| 熒光探針Fluo-3/AM和FuraRed測量單細(xì)胞中比率鈣 中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志1999年第3期第16卷實(shí)驗(yàn)研究作者：馬曉冬朱曉亮趙 清張 瑾張 颯雷國華黃行許鮑永耀單位：馬曉冬趙 清張 瑾張 颯雷國華黃行許鮑永耀（*軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室）；朱曉亮（南方醫(yī)院皮膚科,廣東廣州510515）關(guān)鍵詞：激光掃描共聚焦顯微鏡；Fluo-3/AM；FuraRed；比率鈣... 摘要：應(yīng)用ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM簡稱共焦顯微鏡）和鈣離子指示劑Fluo-3/AM 、FuraRed熒光探劑雙標(biāo)記技術(shù)，測定了單個活細(xì)胞內(nèi)比率鈣的動態(tài)變化。結(jié)果顯示37 ℃, Fluo-3/AM濃度10 μmol/L，F(xiàn)uraRed濃度10 μmol/L的條件下，昆明小鼠巨噬細(xì)胞負(fù)載1 h左右即可獲良好的標(biāo)記效果。用比率探針測量細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)變化，使Ca2+的定性定量測定不受染料濃度、細(xì)胞大小、照射光強(qiáng)度以及一定程度的光漂白和染料泄漏等因素的影響，提供了一種準(zhǔn)確定性定量細(xì)胞內(nèi)Ca2+的實(shí)時、動態(tài)、原位變化的新方法。 中圖分類號：Q74 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-202X（1999）03-0180－03 Ratiometric calcium measurements in single cells with visible wavelength probes fluo-3/AM and furared MA Xiao-donget al. First Military Medical University,Central Laboratory,, ZHU Xiao-liang Department of Dermatology of Nanfang Hospital , Guangzhou 510515,China Key words：laser scanning confocal microscope ; fluo-3/AM; furared; ratiometric calcium. 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+不僅作為一種重要的第二信使廣泛參與細(xì)胞的運(yùn)動、分泌、代謝和分化等多種細(xì)胞功能活動的調(diào)節(jié)[1]；而且胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化與調(diào)控對于參與維持存在于細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞器膜兩側(cè)的跨膜Ca2+梯差，介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[2-4]。因此，在完整細(xì)胞上準(zhǔn)確測定胞內(nèi)游離Ca2+濃度的動態(tài)變化，其重要性是顯而易見的。本文利用ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM），采用單激發(fā)單發(fā)射指示劑Fluo-3/AM和FuraRed雙標(biāo)記法測定了外源性刺激劑地塞米松誘導(dǎo)胞漿游離Ca2+的動態(tài)變化，獲得了良好的測定效果。 1 材料與方法 1.1 材料 （1）試劑：①地塞米松，用不含Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco， 德國），小牛血清（Gibco,德國）。②Fluo-3/AM（biotium公司） 、FuraRed（Molecular Probes Inc,USA）用二甲基亞砜配成1 mmol/L，置于-20℃冰箱保存，PluronicF-127（biotium公司）。③不含Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液（g/L）: 8.01 gNaCl、Na2HPO4.12H2O、0.23 g NaH2PO4.2H2O。④Hepes緩沖液。⑤昆明種雄性小鼠（*軍醫(yī)大學(xué)動物所提供）腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)。 ?。?）儀器：ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（Meridian,USA） 1.2 方法 （1）巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 18～20 g雄性昆明小鼠，按1次/天，1 ml/次連續(xù)三天腹腔注射1%巰基乙醇酸鈉，停一天，按鄂征等人的方法取腹腔巨噬細(xì)胞（臺酚蘭吞噬實(shí)驗(yàn)顯示99％為巨噬細(xì)胞），以1×106個/ml接種于特制的Petri培養(yǎng)皿（Meridian，USA）,用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)于37℃，含5％CO2孵箱內(nèi)。2 d后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 ?。?）熒光探針標(biāo)記 將培養(yǎng)2 d的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用Hepes緩沖液漂洗3次，滴入終濃度為10 μmol/L的Fluo-3/AM 和FuraRed，加入1 μl 25％ pluronic F-127，在37 ℃、5%CO2孵箱中孵育1 h，其間輕輕振蕩幾次，經(jīng)Hepes緩沖液漂洗2次后，再滴入Hepes液0.5 ml。 （3）Ca2+動態(tài)變化的LSCM測定 LSCM由共聚焦顯微鏡主體，激光器（Ar+激光）和微型計(jì)算機(jī)構(gòu)成。激光束的掃描與控制以及圖像數(shù)據(jù)的采集和加工均由計(jì)算機(jī)完成。將標(biāo)記好熒光探劑Fluo-3/AM和FuraRed的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，放入激光掃描共聚焦顯微鏡測定小室，用裝有Olympus IMT-2倒置相差顯微鏡和40×物鏡ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)掃描成像。用488 nm氬離子激光同時激發(fā)兩種染料，用ACAS570多彩色濾光盤（Molti-Color Filter Wheel）提供的530/30 nm帶通濾光器和605 nm長通濾光器將兩者的發(fā)射光分開，用有增輝電路的DageCCD攝像機(jī)，以1.0秒的間隔記錄。數(shù)據(jù)通過圖像采集器直接送入計(jì)算機(jī)，然后用ACAS570-IQ分析軟件分析。 2 結(jié)果 ?。?）用外源性刺激劑地塞米松測得巨噬細(xì)胞中Fluo-3和FuraRed對細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度變化曲線。在本實(shí)驗(yàn)中，將地塞米松（終濃度為1.5μM）加到巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中（100sec后），引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+迅速增加，隨后逐漸達(dá)到平臺。兩種染料的熒光強(qiáng)度動態(tài)變化曲線清楚的表明，加地塞米松時（100sec）引發(fā)Fluo-3熒光急劇增強(qiáng)，同時伴有FuraRed熒光減弱，提示Ca2+增加（圖1）。在加地塞米松前和Ca2+反應(yīng)的峰值時，兩種染料的相對熒光強(qiáng)度以灰度圖表示（圖2）。 圖1 地塞米松刺激后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞負(fù)載Fluo-3/AM和FuraRed的熒光強(qiáng)度變化曲線檢測器1（Det1）Fluo-3/AM通過530/30nm帶能濾光器后單激發(fā)的熒光強(qiáng)度變化曲線檢測器2（Det2） FuraRed 通過605 nm長通濾光器后單激發(fā)的熒光強(qiáng)度變化曲線 （上圖） （下圖） 圖2 地塞米松處理前，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞負(fù)載Fluo-3/AM、FuraRed的熒光灰度圖像（上圖）和處理后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞負(fù)載Fluo-3/AM、FuraRed的熒光灰度圖像（下圖）。檢測器1（Detector1）表示負(fù)載Fluo-3/AM。檢測器2（Detector2）表示負(fù)載FuraRed。 ?。?）為了定量熒光變化，按實(shí)驗(yàn)中每個時間點(diǎn)求得Fluo-3/AM探針發(fā)射強(qiáng)度與FuraRed探針發(fā)射強(qiáng)度的比率。巨噬細(xì)胞對地塞米松反應(yīng)的動態(tài)變化曲線表明，熒光比率迅速增加1.2倍，隨后逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)（圖3）。 圖3 地塞米松處理后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞負(fù)載 Fluo-3/AM、FuraRed的比率熒光動態(tài)變化曲線 3 討論 ?。?）在比率法中用兩種染料同時標(biāo)記，需要其比率在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度不變時保持穩(wěn)定。兩種染料的泄漏、區(qū)域化分布、漂白或代謝等均能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程中比率不穩(wěn)定。Fluo-3/AM和FuraRed都對光漂白敏感，對經(jīng)過10 μmol/LFluo-3/AM和10 μmol/LFuraRed孵育的巨噬細(xì)胞連續(xù)掃描，在本實(shí)驗(yàn)中地塞米松處理之前兩種染料熒光強(qiáng)度的基線值（圖1）及其比率熒光強(qiáng)度的基線值（圖3）都是穩(wěn)定的。這些結(jié)果表明：巨噬細(xì)胞中染料無預(yù)先發(fā)生的光漂白或泄漏；Fluo-3/AM和FuraRed用在比率法中是可行的。 （2）FuraRed是近年來研制的一種*的Ca2+指示劑，發(fā)射640nm波長的熒光，熒光強(qiáng)度隨FuraRed與Ca2+結(jié)合的增加而減弱[5,6]。相反Fluo-3發(fā)射530nm較短波長的熒光，熒光強(qiáng)度隨Fluo-3/AM與Ca2+結(jié)合的增加而增強(qiáng)[7,8]。據(jù)此提供了一種定量細(xì)胞內(nèi)Ca2+可見光激發(fā)的比率方法：將Fluo-3/AM和FuraRed聯(lián)合使用，用488nm的可見光（激光）激發(fā)，來測定細(xì)胞內(nèi)比率Ca2+的實(shí)時、動態(tài)變化。由于這兩種染料與Ca2+結(jié)合發(fā)出的熒光量呈相反的變化，所以增加了對Ca2+檢測的靈敏度。 ?。?）Fluo-3/AM和FuraRed都是很好的Ca2+指示劑。聯(lián)合使用兩種指示劑，用單一可見光激發(fā)能為用比率法測量細(xì)胞內(nèi)比率Ca2+提供一種*的有價(jià)值的方法。類似的比率測定法還有很多，如用兩種染料同時測量Ca2+和pH[5,9]。但這些方法需要兩種不同的熒光探針，而且須特別注意染料負(fù)載、光漂白和染料泄漏，每一種因素在各次實(shí)驗(yàn)之間可能明顯地影響比率。使用Fluo-3/AM和FuraRed能提供一種Ca2+測量方法并具有可見光激發(fā)的優(yōu)點(diǎn)。 參考文獻(xiàn)： [1] Capham D E. 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