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ELI-SPOT 及其應(yīng)用

閱讀：1315      發(fā)布時(shí)間：2013-6-19
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一、            原理
ELI-SPOT，即斑點(diǎn)ELISA，是利用酶標(biāo)板作反應(yīng)容器進(jìn)行的酶聯(lián)免疫反應(yīng)。其基本原理與ELISA相同。首先用捕獲抗體包被反應(yīng)板，封閉后，依次加入待檢標(biāo)本、生物素化檢測(cè)抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶及底物，陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)顯色，利用倒置顯微鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于可在與體內(nèi)（活體條件）極接近的條件下，在體外對(duì)細(xì)胞分泌成分（如細(xì)胞因子、Fas等）進(jìn)行追蹤研究。
幾點(diǎn)說(shuō)明：
l        反應(yīng)板：ELI-SPOT所用的反應(yīng)板可以是PVDF膜包被好的，也可以是普通酶標(biāo)板。如用普通酶標(biāo)板，需用特制的瓊脂糖底物溶液。因此，ELI-SPOT又可分為PVDF法和瓊脂糖法。
l        待檢標(biāo)本須制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)劑刺激后產(chǎn)生相應(yīng)的因子。
l        細(xì)胞誘導(dǎo)方法：細(xì)胞誘導(dǎo)可分為直接法和間接法。如果細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程是在抗體包被的反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行的，即為直接法；如果細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程是在24孔板或燒杯中進(jìn)行的，即為間接法。采用直接法還是間接法取決于以下幾個(gè)方面：?待分析細(xì)胞的類(lèi)型。‚預(yù)期的能分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)。如果預(yù)期的可分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞量少，建議使用直接法；如果可分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞量特別高，用間接法。
l        誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)時(shí)間的選擇：與待檢因子種類(lèi)相關(guān)，參照下表（廠家提供，僅供參考）
待檢因子
樣本來(lái)源
誘導(dǎo)劑
誘導(dǎo)時(shí)間
檢測(cè)用細(xì)胞量
Human IL-2
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
5x104-1x105
Human IL-4
CD4+ T細(xì)胞
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x105-2.5x105
Human IL-6
PBMC
LPS
10-15 hours
1x104-2.5x104
Human IL-10
PBMC
LPS
20-24 hours
2x105-2.5x105
Human IL-12
PBMC
LPS
Overnight
1x105-2.5x105
Human IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Human TNF-α
PBMC
LPS
10-15 hours
2x104-4x104
Human Fas L
PBMC
Anti-human CD3
（B-B11）, IL-2,
/ PMA,Ionomycin
3days,10-15 hours
3x105-4x105
Murine IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Rat IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Rat TNF-α
Rat splenocyte
LPS
10-15 hours
2x104-4x104
 
二、            ELI-SPOT 操作步驟
A：PVDF法
1． 96孔PVDF包被板經(jīng)70%已醇處理后，用捕獲抗體進(jìn)行包被。
2． 單細(xì)胞懸液（含適當(dāng)誘導(dǎo)劑）加入反應(yīng)孔內(nèi)，孵育（直接法）；如用間接法，細(xì)胞在24孔板或燒杯中誘導(dǎo)后，取適量誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞懸液加入到反應(yīng)孔內(nèi)。
3． 倒掉細(xì)胞，加入生物素化檢測(cè)抗體，孵育。
4． 加鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
5． 加入BCIP/NBT底物，形成斑點(diǎn)。
B：瓊脂糖法
1． 用捕獲抗體包被酶標(biāo)板。
2． 單細(xì)胞懸液（含適當(dāng)誘導(dǎo)劑）加入反應(yīng)孔內(nèi)，孵育（直接法）。如用間接法，細(xì)胞在24孔板或燒杯中誘導(dǎo)后，取適量誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞懸液加入到反應(yīng)孔內(nèi)。
3． 倒掉細(xì)胞，加入生物素化檢測(cè)抗體，孵育。
4． 鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
5． 加入瓊脂糖底物溶液，形成斑點(diǎn)。
 
三、            ELI-SPOT 檢測(cè)單細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的意義
細(xì)胞因子是一類(lèi)由白細(xì)胞和其它一些細(xì)胞產(chǎn)生的，可在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞。大多數(shù)細(xì)胞因子是生長(zhǎng)或分化調(diào)節(jié)因子，通常在造血系統(tǒng)中發(fā)揮作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在腦、肌肉和內(nèi)分泌器官間也存在相互作用，另外，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些疾病中，如急性炎癥、血液病、癌癥和自身免疫性疾病中可常見(jiàn)細(xì)胞因子的異常表達(dá)。
在單細(xì)胞水平進(jìn)行細(xì)胞因子的監(jiān)測(cè)提供了zui接近“原位”環(huán)境的，即zui接近體內(nèi)條件，觀察細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法。這正是ELI-SPOT方法的特性。它可使科研工作者在體外進(jìn)行與體內(nèi)環(huán)境相似的研究。利用這一方法，可跟蹤細(xì)胞因子的產(chǎn)生、跟蹤疾病進(jìn)展、調(diào)整臨床治療策略、防止病情惡化以及致命后果的發(fā)生。
 
四、            ELI-SPOT應(yīng)用
1． 在自身免疫腦脊髓炎疾病研究中，給大鼠注射干擾素β后，可顯著隆低可產(chǎn)生干擾素γ的細(xì)胞的數(shù)量。（1）
2． 進(jìn)行免疫基因肽疫苗的評(píng)價(jià)。（2）
3． 接種途徑效果的評(píng)估。（3）
4． 研究TH1/TH2 T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的方式以及由一個(gè)亞群向另一個(gè)亞群轉(zhuǎn)換的情況。（4，5）
5． 成功檢測(cè)黑色素瘤中腫瘤活性T細(xì)胞數(shù)量。（6）
6． 用于重癥肌無(wú)力患者外周血IFN-γ、IL-10分泌性T細(xì)胞的研究。（7）
 
五、            參考文獻(xiàn)：
1． Ruuls, S.R. et al., 1996  J. Immunol. 157:5721
2． Kulane, A. et al., 1997  Acta Tropica. 68:37
3． Ibsen, M. W. et al., 1997  Scand. J. Immunol. 46:274
4． Gabrielsson, S. et al., 1997  Allergy. 52:860
5． Elaghazali, G. et al., 1997  Clin. Exp. Immunol. 109:84
6． Scheibenbogen, C. et al. 1997  Int. J. Cancer 71:932
7． 侯世芳，閆曉波，王維治，1999  第六屆全國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編

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