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Biocoat腫瘤侵襲系統(tǒng)

BD 產(chǎn)品貨號(hào)：354166, 354165

儲(chǔ)存和運(yùn)輸：-20度儲(chǔ)存，干冰運(yùn)輸。

使用指南:

BD Biocoat^TM 腫瘤侵襲系統(tǒng)由包被Matrigel基質(zhì)的特殊材質(zhì)BD FluoroBlok 熒光屏蔽8.0μm PET膜的培養(yǎng)小室組合而成。BD Biocoat^TM 腫瘤侵襲系統(tǒng)具有以下特點(diǎn)：提高腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的通量；自動(dòng)化非破壞式的熒光檢測(cè)；節(jié)約抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選的時(shí)間和勞動(dòng)力；高度可重復(fù)性：平均z’=0.7(24孔)；平均z’=0.66(96孔)；使用簡(jiǎn)便：無(wú)需反復(fù)取液和操作，僅需加入細(xì)胞、標(biāo)記物，然后直接讀板。

操作過程:

凍融

從-20℃冰箱中取出產(chǎn)品，使其自然升溫到室溫。取出培養(yǎng)板在細(xì)胞小室內(nèi)加入到500μL 37℃預(yù)熱的PBS，37℃無(wú)CO2環(huán)境下孵育2小時(shí)。解凍后，小心去除小室內(nèi)的培養(yǎng)基，避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。

BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標(biāo)記法

細(xì)胞通過侵襲消化基質(zhì)膜后遷移到下小室，采用熒光標(biāo)記定量細(xì)胞。細(xì)胞的侵襲能力用終點(diǎn)計(jì)算法計(jì)算得到。對(duì)于采用實(shí)時(shí)動(dòng)力曲線的計(jì)算，推薦使用前標(biāo)記法。

2.1 如步驟1準(zhǔn)備培養(yǎng)板。

2.2 胰酶消化細(xì)胞單層后制得細(xì)胞懸液，溶于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，推薦濃度為5×104 cells/mL。

2.3 上小室中加入500μL細(xì)胞懸液（2×104 cells）。

2.4 通過進(jìn)樣口在下小室中加入750μL誘導(dǎo)劑。

2.5 在37℃，5%CO2 條件下孵育培養(yǎng)板和對(duì)照板20-22小時(shí)（由細(xì)胞類型決定）。

2.6 孵育后，小心去除上小室中的培養(yǎng)基。避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。可以通過反扣住培養(yǎng)板，輕輕拍打，以使培養(yǎng)基的傾倒。

2.7 將培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)移到另一塊24孔板中，該孔板含有0.5 mL每孔的4μg/mL 鈣黃綠素（溶于HBSS）。在37℃，5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)一小時(shí)。

3、DilC12（3）熒光染色劑預(yù)標(biāo)記法

細(xì)胞接種于孔板之前先用染色劑標(biāo)記，可用于均一化實(shí)驗(yàn)，所產(chǎn)生的實(shí)時(shí)動(dòng)力數(shù)據(jù)可揭示細(xì)胞通過基底膜侵襲的動(dòng)力曲線，不需要分解和破壞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

3.1如1.所示凍融。

3.2 10μg/mLDilC12(3)溶解于含10%FBS的DMEM中，37℃ 1小時(shí)標(biāo)記單層細(xì)胞。

3.3 胰酶消化細(xì)胞單層，制備細(xì)胞懸液，溶于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，濃度為1×105 cells/mL。

3.4 上小室加入500μL細(xì)胞懸液（5×104cells）。

3.5通過進(jìn)樣口在下小室加入750μL誘導(dǎo)劑。

3.6 在37℃，5%CO2環(huán)境下孵育培養(yǎng)板和對(duì)照板18-24小時(shí)（由細(xì)胞類型決定）。在549激發(fā)波長(zhǎng)和565nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下進(jìn)行熒光讀數(shù)。

4、數(shù)據(jù)計(jì)算

侵襲率%=受趨化劑誘導(dǎo)通過Matrigel基質(zhì)膜的細(xì)胞平均相對(duì)熒光值/受趨化劑誘導(dǎo)通過未包被FluoroBlok熒光膜的細(xì)胞平均相對(duì)熒光值×100

注意：數(shù)據(jù)可以用相對(duì)熒光值RFU或侵襲百分比表示，后者在標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理中更有用。背景扣除，計(jì)算平均背景值，將其從各個(gè)孔板中扣除。

自動(dòng)化操作注意事項(xiàng)

BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養(yǎng)小室系統(tǒng)能適用于自動(dòng)化操作系統(tǒng)。蓋子可以用標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械手取走，也可用吸力取走。為了避免各孔間污染，孔板設(shè)定為一個(gè)統(tǒng)一的方向。為了與培養(yǎng)小室匹配，確保Falcon的商標(biāo)均在2者上方，面向同一個(gè)方向。任何規(guī)格的槍頭都能達(dá)到小室的兩邊。包括50μL，100μL，200μL，250μL，1000μL。