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免疫組化染色注意事項(xiàng):
免疫組化染色方法已不是什么很難的問(wèn)題，操作步驟簡(jiǎn)單也易掌握，但要染好免疫組化，其中方法的技巧將是每位操作者在實(shí)際工作中不斷摸索和探討的事：
（1）去除內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素　
一般我們進(jìn)行免疫組化標(biāo)記的都是一些生物體組織，其中自身含有一定量的內(nèi)源酶和內(nèi)源性生物素，而免疫組化各種染色大部分是用過(guò)氧化物酶來(lái)標(biāo)記抗體的，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，而組織中的內(nèi)源性酶同樣也能催化底物，使其顯色，這就影響免疫組化的特異性，所以在標(biāo)記抗體的過(guò)氧化酶進(jìn)人組織切片之前就應(yīng)設(shè)法將組織內(nèi)的內(nèi)源性各種酶滅活，以保證免疫組化染色在特異性情況下進(jìn)行。
1) 去除內(nèi)源酶　
常用的去除內(nèi)源性酶的方法是3%過(guò)氧化氫水溶液。但在含有豐富血細(xì)胞的標(biāo)本中，由于其中含有大量的具有活性的過(guò)氧化物酶，能與過(guò)氧化氫反應(yīng)，出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象，易對(duì)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生一些不良影響，但用3%過(guò)氧化氫的方法，能夠去除大部分內(nèi)源性酶，即使有些血細(xì)胞在顯色后也出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)，但由于其形態(tài)結(jié)構(gòu)與組織細(xì)胞不同，也易鑒別，而且此方法比較通用易操作，但應(yīng)注意過(guò)氧化氫的濃度不能過(guò)高，一般為3%一5%，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，室溫10min。
2) 去除內(nèi)源性生物素　
在正常組織細(xì)胞中也含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合卵白素，形成卵白素一生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進(jìn)行0.01%卵白素溶液室溫處理20min，使其結(jié)合位點(diǎn)飽和，以消除內(nèi)源性生物素的活性。
3) 滅活堿性磷酸酶　
zui常用的方法是將左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值為7.6~8.2，能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對(duì)于仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。
（2）抑制非特異性背景著色　
非特異性著色zui常見(jiàn)的情況是抗體吸附到組織切片中高度荷電的膠原和結(jié)締組織成分上，而出現(xiàn)背景著色，為了防止這種現(xiàn)象，用特異性抗體來(lái)源的同種動(dòng)物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進(jìn)行處理，以封閉荷電點(diǎn)，不讓一抗與之結(jié)合，但這種方法一般實(shí)驗(yàn)室很難實(shí)現(xiàn)，一般常見(jiàn)實(shí)用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室溫下作用10~30min即可，但應(yīng)注意此種結(jié)合是不牢固結(jié)合，所以不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對(duì)于多克隆抗體來(lái)講，易產(chǎn)生背景著色，在稀釋特異性抗體時(shí)可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。
（3）緩沖液　
免疫組化染色標(biāo)記是對(duì)生物體組織抗原進(jìn)行標(biāo)記，抗原抗體的pH值為7.2~7.6，zui常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸緩沖液(PBS)。簡(jiǎn)易配法：5000ml蒸餾水中分別加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記物底物的方法時(shí)可以用0.02mol/L TBS pH8.2緩沖液比較好。
（4）抗原修復(fù)　
經(jīng)甲醛固定的部分組織細(xì)胞，可使免疫組化標(biāo)記敏感性明顯降低，這是因?yàn)榧兹┕潭ㄟ^(guò)程中形成醛鍵或保存的甲醛會(huì)形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時(shí)，有些抗原需先進(jìn)行修復(fù)或暴露。
抗原修復(fù)方法可分為化學(xué)方法和物理方法。化學(xué)方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度與消化時(shí)間要適度。常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。在選用這三種加熱法時(shí)，浸泡切片的緩沖液的離子強(qiáng)度和PH值、加熱的溫度和時(shí)間均影響著抗原修復(fù)效果。目前zui常用的修復(fù)方法有如下凡種：
1）胰蛋白酶(Trpsin)　　
主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。一般使用濃度為0.1%，37℃作用10min。
配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(無(wú)水)水溶液中溶解后即可。
2）胃蛋白酶(Pepsin)　　
主要用于細(xì)胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復(fù)。一般濃度為0.4%，37℃作用30min。
配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。
3）熱引導(dǎo)的抗原決定簇修復(fù)(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER)　
HIER對(duì)大多數(shù)的抗體有益，尤其是對(duì)核抗原的修復(fù)作用更加明顯，zui常用的抗原修復(fù)液是pH6.0的枸櫞酸緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過(guò)鈉離子的螯合而實(shí)現(xiàn)的?？乖迯?fù)液的pH值非常重要，有效的抗原修復(fù)pH值要比修復(fù)液的化學(xué)成分更重要，同樣的修復(fù)液隨著pH值的升高染色的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但*pH值范圍為6.0~10.0，對(duì)于大多數(shù)抗原這個(gè)范圍的pH值都能進(jìn)行有效的修復(fù)，有些抗體(如Ki-67、ER)則在pH值l.0~3.0和6.0~8.0更為有效。作為通用修復(fù)液堿性pH值的修復(fù)液要比酸性的有效，而對(duì)固定很長(zhǎng)時(shí)間舊的存檔組織，酸性pH值的修復(fù)液則優(yōu)于堿性的修復(fù)液，所以兩種抗原修復(fù)液可作為相互替補(bǔ)的進(jìn)行抗原修復(fù)。在進(jìn)行HIER過(guò)程中應(yīng)防止切片的干燥，加熱時(shí)必須達(dá)到規(guī)定的溫度，保溫時(shí)間要足夠，對(duì)于一些不要抗原修復(fù)的抗體不要采用HIER處理，否則對(duì)染色無(wú)益，但有些抗體則需要利用多種修復(fù)聯(lián)合應(yīng)用。
HIER方法有：
1)水浴加熱法　
將脫蠟入水后的切片放人盛有修復(fù)的容器中，放人加熱煮沸水中，當(dāng)修復(fù)液溫度達(dá)到95℃左右時(shí)計(jì)時(shí)l5min，自然冷卻，PBS洗3min×3次。
2)微波加熱法　
將切片放入修復(fù)液中微波加熱使溫度在96℃左右，計(jì)時(shí)l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。
3)高壓加熱法　
將修復(fù)液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中(要使修復(fù)液淹沒(méi)切片)開(kāi)始噴氣時(shí)蓋上壓力閥。計(jì)時(shí)2min，冷水沖至室溫取出切片，PBS洗3min×3次。
（5） 顯色　
免疫組化染色的顯色是zui后的關(guān)鍵問(wèn)題，一般辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的檢測(cè)系統(tǒng)選用DAB或AEC顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。但要得到*的顯色效果，必須在鏡下嚴(yán)格控制，以檢出物達(dá)到zui強(qiáng)顯色而背景無(wú)色為zui終點(diǎn)，尤其DAB顯色時(shí)間短著色淺，時(shí)間長(zhǎng)背景又深，都將影響結(jié)果判斷，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)DAB在配制完后zui長(zhǎng)宜放置30min以內(nèi)，過(guò)時(shí)不能使用，DAB加到組織切片時(shí)作用時(shí)間zui長(zhǎng)不宜超過(guò)10min(在5min內(nèi))，否則不管有無(wú)陽(yáng)性都應(yīng)終止反應(yīng)。對(duì)一些含有內(nèi)源性酶較高的組織用DAB顯色時(shí)極易出現(xiàn)背景色更應(yīng)盡早在鏡下控制，以達(dá)到*的分辨效果（棕色）。AEC顯色系統(tǒng)（紅色）的弊端是易溶于有機(jī)溶劑，所以封片時(shí)應(yīng)以水性封片劑為主，同時(shí)染色的切片也不能久存。
如果是堿性磷酸酶(AP)選用NBT/BCIP作為顯色系統(tǒng)（結(jié)果染為藍(lán)黑色）。
（6） 結(jié)果判斷　
免疫組化的結(jié)果判斷有兩種方法：
一是對(duì)以檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)來(lái)定性(如核抗原的標(biāo)記)，判斷方法是以一個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的百分比，再取10個(gè)相同視野算取平均指數(shù)。
另一種方法以染色陽(yáng)性強(qiáng)度和陽(yáng)性檢出率相結(jié)合而定，一般陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在0~25為陰性，25~50為+，50~75為++，75以上為+++。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。
有條件的實(shí)驗(yàn)室能用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)定量分析更為準(zhǔn)確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結(jié)果判斷更標(biāo)準(zhǔn)，但各單位采取的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，所以判斷標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題還有待長(zhǎng)期實(shí)踐中病理學(xué)術(shù)界商討判定標(biāo)準(zhǔn)。
IHC中常見(jiàn)的抗原表達(dá)模式有以下幾種：
1）細(xì)胞漿內(nèi)彌漫性分布，多數(shù)胞漿型抗體的反應(yīng)如此，如細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；
2）細(xì)胞核周的胞漿內(nèi)分布，其判別要點(diǎn)是細(xì)胞核的輪廓被勾畫(huà)得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；
3）胞漿內(nèi)局限性點(diǎn)狀陽(yáng)性，如CDl5抗體的染色；
4）細(xì)胞膜線性陽(yáng)性，大多數(shù)淋巴細(xì)胞標(biāo)記的染色如此，如CD20、CD45RO；
5）細(xì)胞核陽(yáng)性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的陽(yáng)性表達(dá)，如EMA可呈膜性和胞漿內(nèi)彌漫性陽(yáng)性反應(yīng)；CD30抗體可同時(shí)呈膜性和胞漿內(nèi)點(diǎn)狀陽(yáng)性反應(yīng)等。
（7） 對(duì)照片的設(shè)置　
免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對(duì)照，沒(méi)有對(duì)照的免疫組化結(jié)果是毫無(wú)意義的。對(duì)照包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和自身對(duì)照。在實(shí)踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對(duì)照，而用含抗原的正常組織作陽(yáng)性對(duì)照，這種自我對(duì)照具有節(jié)約的意義。觀察染色結(jié)果時(shí)，先觀察對(duì)照組織的結(jié)果，如陽(yáng)性對(duì)照組織中陽(yáng)性細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，陰性對(duì)照細(xì)胞呈陰性，內(nèi)源酶陰性，背景無(wú)非特異性染色時(shí)，表明本次實(shí)驗(yàn)的全部試劑和全過(guò)程技術(shù)操作準(zhǔn)確無(wú)誤，待檢組織中的陽(yáng)性細(xì)胞也就是可信的正確結(jié)果。 免疫組化染色中對(duì)照片的設(shè)置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測(cè)每一個(gè)抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，常設(shè)的對(duì)照如下，一般實(shí)驗(yàn)zui常用的只選第二種方法。
1）空白對(duì)照(陰性對(duì)照)　 *抗體由PBS或非免疫血清取代。
2）陽(yáng)性對(duì)照　 用已知含有要檢測(cè)抗原的切片作陽(yáng)性對(duì)照。
3）回收實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照　已知抗原與相應(yīng)的*抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。
4）替代對(duì)照　用于*抗體同種動(dòng)物的血清或無(wú)關(guān)抗體代替*抗體結(jié)果為陰性。
5）自身對(duì)照　在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陽(yáng)性或陰性結(jié)果與檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽(yáng)性，vimentin可以間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)照desmin以血管壁及肌束為對(duì)照，S-l00蛋白以小神經(jīng)末梢為對(duì)照等，如果應(yīng)為陽(yáng)性的組織是陽(yáng)性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問(wèn)題或免疫試劑質(zhì)量有問(wèn)題。

免疫組化技術(shù)要點(diǎn):
1. 固定
用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書(shū)。
（1）BouinS固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。
（2）PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。
2. 組織脫水、透明
時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整。
3. 切片時(shí)展片
有些組織在切片后難以在水中展開(kāi)，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?/span>
4. 烤片
60℃ 30分鐘或37℃ overnight，溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)，抗原容易丟失。
5. 蠟塊及切片的保存
在4℃保存
6. 脫片問(wèn)題
Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。
7. 滅活內(nèi)源性酶
（1）HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活
（2）AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。
8. 暴露抗原
對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的*修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說(shuō)明書(shū))。對(duì)于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。
9. 封閉
在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉
10. 抗體稀釋
應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。
11. 背景高
在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。
12. 返藍(lán)
在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。
13. 顯色
一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。
14. 在整個(gè)操作過(guò)程中，切片千萬(wàn)不能干燥，否則會(huì)有非特異性染色。
15. 拍照
免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測(cè)量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動(dòng)白平衡在起作用。另外一個(gè)因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。