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鈣衛(wèi)蛋白ELISA 檢測(cè)試劑盒

生產(chǎn)廠家：德國Immundiagnostik公司

貨號(hào)： K6927

1.應(yīng)用：

該試劑盒用于定量檢測(cè)人糞便中的鈣網(wǎng)蛋白含量。

2. 簡介：

鈣衛(wèi)蛋白是一類主要由單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌的鈣結(jié)合蛋白。糞便鈣衛(wèi)蛋白是腫瘤及胃腸道疾病的檢測(cè)標(biāo)記物。臨床上常常很難區(qū)分腸道易激綜合征和慢性炎癥腸道疾病。這就導(dǎo)致常常需要做大量的非必要的結(jié)腸鏡檢查。而鈣衛(wèi)蛋白可以很清楚的分辨這兩種疾病。糞便鈣衛(wèi)蛋白與組織學(xué)及鏡檢檢測(cè)炎癥性腸病及潰瘍性結(jié)腸炎以及被視為腸道疾病檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)的indium-111標(biāo)記嗜中性粒細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果呈顯著相關(guān)性。然而，用indium-111標(biāo)記嗜中性粒細(xì)胞檢測(cè)腸道疾病費(fèi)用成本非常高（住院費(fèi)用，分析檢測(cè)及同位素處理），同時(shí)患者還需要做放射性檢測(cè)。由于這個(gè)原因，不推薦用這個(gè)方法用于反復(fù)檢測(cè)小孩或孕婦患者。

鈣衛(wèi)蛋白是優(yōu)于其他炎癥類標(biāo)記物（CRP，ESR HB）用于腸道疾病復(fù)發(fā)檢測(cè)的的一個(gè)*的預(yù)測(cè)標(biāo)記物。與標(biāo)準(zhǔn)的用大便潛血檢測(cè)結(jié)腸癌相比，糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)明顯占有優(yōu)勢(shì)。如果糞便中的鈣衛(wèi)蛋白含量很低，說明腸道疾病發(fā)生的概率極小。

3.試劑盒組分：

4. 試劑制備與保存：

• 如果不是單次用完試劑盒，請(qǐng)按試劑瓶標(biāo)簽上說明保存相應(yīng)試劑。按照單次的使用量制備相應(yīng)試劑。
• 體積少于100ul的試劑，在用前請(qǐng)離心。
• 洗滌緩沖液在用前用超純水做10倍稀釋（100ml儲(chǔ)液+900ml超純水），充分混勻。由于是高濃度的儲(chǔ)液，在儲(chǔ)存過程中可能會(huì)有結(jié)晶出現(xiàn)。如出現(xiàn)結(jié)晶請(qǐng)?jiān)谑覝鼗?/span>37℃待結(jié)晶*溶解。稀釋后的緩沖液可在2-8℃保存一個(gè)月。
• 提取緩沖液在用前用超純水1:2.5稀釋（100ml IDK Extract +150ml超純水），充分混勻。如出現(xiàn)結(jié)晶請(qǐng)?jiān)谑覝鼗?/span>37℃待結(jié)晶*溶解。稀釋后的緩沖液可在2-8℃保存一個(gè)月。稀釋后的緩沖液可在2-8℃保存一個(gè)月。
• 標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照，需用500ul超純水稀釋。將瓶內(nèi)容物至于室溫溶解10min，然后輕柔上下顛倒混勻，確保充分溶解。重懸后的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照可在2-8℃保存4周。
• 其他的時(shí)間均為即用型試劑。

5. 樣品制備和保存

大便樣本

糞便中的鈣衛(wèi)蛋白在室溫可保存3天。盡管這樣，我們推薦糞便在2-8℃保存時(shí)間不要超過48h。長期保存，請(qǐng)置于-20℃保存。冰凍的糞便樣本，請(qǐng)?jiān)诜治銮跋戎糜?/span>2-8℃，然后在置于室溫解凍。冰凍可導(dǎo)致糞便中的嗜中性粒細(xì)胞釋放鈣衛(wèi)蛋白，因此冰凍樣本相對(duì)于新鮮樣本來說，鈣衛(wèi)蛋白含量稍高。

糞便樣本中的一些添加劑，可能會(huì)對(duì)鈣衛(wèi)蛋白的檢測(cè)起到干擾作用。因此請(qǐng)使用：空的離心管或試劑盒提取緩沖液加到管內(nèi)。

糞便提取物

糞便提取在室溫、2-8℃、-20℃均可保持穩(wěn)定性9天，反復(fù)凍融不要超過3次。

糞便樣本的提?。?/span>

稀釋的提取緩沖液（Diluted extraction buffer IDK Extract）用作樣本提取的緩沖液。我們推薦用以下方法制備糞便提取物。

Stool Sample Application System(SAS) (Cat.No.:K6998SAS)

糞便樣本管：

請(qǐng)注意樣本的稀釋倍數(shù)依據(jù)糞便量及緩沖液體積決定。

用1.5ml緩沖液稀釋SAS

請(qǐng)按照SAS說明書制備糞便樣本：

1. 冰凍的糞便樣本，需要先解凍。對(duì)于一些特殊的樣本，需要?jiǎng)驖{
2. 提取樣本前，在空離心管內(nèi)加入1.5ml IDK Extract extraction Buffer.加入后，置于室溫。
3. 打開管蓋。插入量油尺后，中下部的量油尺有一凹槽，需要用糞便*覆蓋。當(dāng)將stick插入管內(nèi)后，過多的量將溢出，而剩下15mg需要稀釋的糞便樣本。蓋上管蓋。
4. 搖動(dòng)離心管，直至在凹槽沒有糞便樣本存在，請(qǐng)確保充分溶解。對(duì)于一些固體樣本，樣本用緩沖液浸濕10min，有利于樣本檢測(cè)。
5. 讓樣本置于管內(nèi)10min，確保沉淀充分溶解，漂浮的一些類似谷類的物質(zhì)，可忽略不計(jì)。
6. 輕輕的打開管蓋以及量油尺的綠色的環(huán)。丟棄蓋子以及量油尺，確保收集到的沉積物不再分散。

Dilution I :  1:100 稀釋提取物

重懸后的樣本用樣本稀釋緩沖液（SAMPLEBUF）1:25稀釋。例如：

40 ul懸液+960ul樣本稀釋緩沖液=1:25(Dilution I)，zui終稀釋比：1:2500

取100ul樣本用于檢測(cè)。

6. 檢測(cè)程序：

檢測(cè)原理:

試劑盒采用雙抗夾心ELISA檢測(cè)原理。標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照和稀釋的檢測(cè)樣本與包被的人鈣衛(wèi)蛋白抗體發(fā)生反應(yīng)。孵育，樣本中的鈣衛(wèi)蛋白月包被抗體發(fā)生結(jié)合。酶標(biāo)的抗體加入后，形成：包被抗體-人鈣衛(wèi)蛋白-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。加入TMB底物顯色，zui后加入終止液終止反應(yīng)。顯色從藍(lán)色到黃色，顏色的深淺反應(yīng)了樣本中鈣衛(wèi)蛋白含量的高低。用標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本的OD值，計(jì)算樣本中鈣衛(wèi)蛋白含量。

檢測(cè)程序：（推薦做復(fù)孔）

1. 將樣本和試劑置于室溫（15-30℃）平衡。
2. 在操作流程上標(biāo)記處，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本及對(duì)照所在孔位置。
3. 根據(jù)要做的樣本量，選著適當(dāng)數(shù)目的板條。剩余板條覆蓋后，2-8℃保存。
4. 加入：標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、對(duì)照各加100ul到對(duì)應(yīng)孔。
5. 覆蓋版，室溫孵育30min
6. 吸出孔內(nèi)液體，用250ul 洗液，洗滌5次。zui后洗滌結(jié)束后，在吸水紙上排干孔內(nèi)液體。
7. 加入100ul標(biāo)記抗體到各孔。
8. 覆蓋版，室溫孵育30min
9. 吸出孔內(nèi)液體，用250ul 洗液，洗滌5次。zui后洗滌結(jié)束后，在吸水紙上排干孔內(nèi)液體。

10)加入100ul SUB（底物） 到各孔。

11) 避光室溫孵育10-20min

12) 加入100ul終止液到各孔，充分混勻

13）讀取450nm吸光度，副波長620nm ( or 690nm)。如果標(biāo)準(zhǔn)品zui高吸光度值超出了儀器檢測(cè)值，請(qǐng)立即讀取405nm吸光度，副波長620nm。

   注：顏色變化受溫度影響較大，我們推薦：看到顏色差異后，終止反應(yīng)。

對(duì)于一些ELISA自動(dòng)化儀器，請(qǐng)依據(jù)儀器特點(diǎn)，調(diào)整檢測(cè)流程。

7. 結(jié)果

以下方法用于計(jì)算檢測(cè)結(jié)果。我們推薦4-參數(shù)算法。

1）4Parameter algorithm

2）Point to point calculation

3) Spline algorithm

計(jì)算結(jié)果，依據(jù)稀釋倍數(shù)，樣本zui終濃度需x2500。

8. 局限

樣本OD超過標(biāo)準(zhǔn)品zui高OD值時(shí)，需要 樣本后再測(cè)。

9.質(zhì)控

需要在每次試驗(yàn)時(shí)，都做質(zhì)控。質(zhì)控值，用于評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)方法的可行性。如果質(zhì)控檢測(cè)超過范圍，說明樣本檢測(cè)值是無效的。

檢測(cè)范圍：

1g 糞便相當(dāng)于1ml.

• 健康人群的均值為25mg/kg
• 超過50mg/kg的樣本檢測(cè)值，認(rèn)為是陽性的。

推薦各個(gè)實(shí)驗(yàn)室依據(jù)自身實(shí)驗(yàn)，確定樣本的參考值范圍。

注：許多復(fù)雜的因素可導(dǎo)致沒有炎性腸病的情況下，但是糞便中鈣衛(wèi)蛋白含量卻升高。例如：使用非甾體抗炎藥，一些間歇性的胃腸感染及一些惡性腫瘤都會(huì)導(dǎo)致鈣衛(wèi)蛋白含量卻升高。

在解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果及炎性腸病治療效果評(píng)價(jià)中應(yīng)考慮這些因素。

兒童糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)范圍：

據(jù)文獻(xiàn)：Hestvik E et al. (2011) BMC Pediatrics 11:9 doi:10.1186/1471-2431-11-9

方法：來自于坎帕拉、烏干達(dá)，0-12歲的302個(gè)健康兒童檢測(cè)了糞便鈣衛(wèi)蛋白

表1.不同年齡段兒童糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)結(jié)果

文獻(xiàn)：Fagerberg UL et al. (2003) J Pediatr Gastroenterol Nutr 37:468-472

10 試劑盒參數(shù)：

精密度

批內(nèi)（n=20）

批間（n=12）

特異性：

試劑盒便于溶菌酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、乳鐵蛋白發(fā)生反應(yīng)。

稀釋比：三個(gè)不同患者樣本用樣本稀釋緩沖液不同吧比例稀釋后分析后的結(jié)果。（n=3）

分析靈敏度：

• 不考慮稀釋比為：2.099ng/ml
• 考慮稀釋比為：5.2475mg/L