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                                                      第九章 蛋白顯色

    酶促反應(yīng)比同位素安全且快速，已經(jīng)成為 Western Blot 的主流檢測(cè)方法。酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實(shí)現(xiàn)不同的顯色方法：化學(xué)發(fā)光和底物顯色，前者靈敏度很高，已經(jīng)達(dá)到皮克級(jí)別，甚至還有飛克級(jí)別的，靈敏度超過(guò)了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡(jiǎn)便且成本低。

    大家zui為熟悉熟悉當(dāng)數(shù)辣根過(guò)氧化物酶 HRP（Horseradish Peroxidase）和堿性磷酸酶 AP（AlkalinePhosphatase），此外還有比較少見(jiàn)的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）和 β 半乳糖苷酶（β-Galactosidase）。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無(wú)色的底物 5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過(guò)氧化物酶可以以H2O2為底物，將 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?/span> 4-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過(guò)氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大 1000 倍，通過(guò)將印跡放在照相底片上感光就可以檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的存在。

① HRP 標(biāo)記二抗用 DAB 顯色，按順序依次將 DAB 三種劑各取 3 滴于 5 ml 蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色 5-15min 終止反應(yīng)，對(duì)照 Marker 記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將 NC 膜晾干掃描保存。HRP的生色底物顯色有 DAB、4-CN、CN/DAB、AEC 和 TMB 等。

               

     HRP 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物主要有 Luminol、ECL 和 SuperSignal 系列?？芍苯訌墓举?gòu)買(mǎi)試劑盒，操作比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用 HRP 標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到 HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

                           

② AP顯色底物生成的產(chǎn)物主要是藍(lán)紫色，成像性好容易拍照。 AP的底物顯然更穩(wěn)定，不像HRP那樣需要新鮮 配制 的 H2O2一 類(lèi) 的不穩(wěn) 定成 分，作 為試 劑盒可 以保 存時(shí)間 更長(zhǎng) 。常用顯 色底物 的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 ’ -Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ， NBT (Nitro-Blue TetrazoliumChloride)和INT。

③ 底物發(fā)光法：將兩種顯色底物 1:1 等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來(lái)，馬上在暗室中將 X 光片覆蓋在膜的上面（時(shí)間根據(jù)光的亮度來(lái)衡量），顯影、定影。（注意：發(fā)光法檢測(cè)的時(shí)候曝光時(shí)間要恰到好處，過(guò)短會(huì)導(dǎo)致曝光不*，影響條帶亮度，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)衰弱，也會(huì)使背景顏色加深）除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗（可通過(guò)紫外燈產(chǎn)生熒光）；生物素結(jié)合的二抗等等。

關(guān)于磷酸化蛋白檢測(cè)的注意事項(xiàng)：

① 保持待測(cè)蛋白處于磷酸化狀態(tài)，在標(biāo)本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標(biāo)本時(shí)刻保持在冰浴中。

② 使用 5%的 BSA 作為封閉試劑，不能使用脫脂奶粉（因?yàn)槊撝谭壑泻欣业鞍祝瑫?huì)出現(xiàn)很高的背景）。

③ 請(qǐng)謹(jǐn)記蛋白的磷酸化是需要誘導(dǎo)的，當(dāng)信號(hào)低或者無(wú)信號(hào)時(shí)有可能是磷酸化誘導(dǎo)不充分！確保使用陽(yáng)性對(duì)照。