蛋白質(zhì)結(jié)晶原理
蛋白質(zhì)結(jié)晶原理(Principles of Protein Crystallization)
蛋白質(zhì)的X射線結(jié)構(gòu)分析首先要獲得合適的單晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)還并沒有*發(fā)展成熟,盡管很受人親睞,特別是有了幾次航天飛機中微重力實驗 (Kundrot et al., 2001; McPherson et al., 1995) 的激發(fā)。蛋白質(zhì)結(jié)晶實驗過程是一個反復(fù)試驗的過程,蛋白質(zhì)逐漸會從溶液中分析出,晶核、雜質(zhì)及其他未知因素對此過程有所影響。通常,蛋白質(zhì)越純,生長晶體的幾率就越大。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)者對蛋白質(zhì)純度的要求要嚴于生化學(xué)家的要求,后者往往在酶催化活性足夠高時就很滿意。另一方面,為了使蛋白質(zhì)結(jié)晶,不僅要加其他成分,所有蛋白質(zhì)分子的表面性質(zhì)也必須是相同的,特別是表面的電荷分布,因為它影響晶體內(nèi)分子的聚集。質(zhì)譜是蛋白質(zhì)結(jié)晶中的一種有效工具,例如檢測重組蛋白的表達、樣品純度、重原子衍生物及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性(Cohen, 1996; Potier et al.,2000)。
蛋白質(zhì)結(jié)晶涉及四個重要步驟如下:
1. 蛋白質(zhì)純度的確定。如果不夠非常純,必須要進一步純化。
2. 蛋白質(zhì)溶解于合適的溶劑中,從中它能通過一種鹽或有機化合物而析出。溶劑通常是水-緩沖劑溶液,有時加有機溶劑,如2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)。正常情況下,沉淀劑也被加入,但是濃度不高于使沉淀產(chǎn)生。對于不溶于水-緩沖劑或水-有機溶劑的膜蛋白,還需要加入去污劑。
3. 蛋白質(zhì)結(jié)晶使溶液過飽和。在這一步中,小聚集體形成,它是晶體生長所需的核。對小分子的結(jié)晶來說,相比于蛋白質(zhì)更為人熟知,晶核的自發(fā)形成需要提供表面張力能。一旦這個能障被突破了,晶體開始生長。能障在高水平的過飽和度時很容易克服。因此,在高過飽和度時,晶核更易自發(fā)形成。晶核的形成可作為一個過飽和度和其他參數(shù)的函數(shù)通過多種方法來研究,包括光散射、熒光去極化及電子顯微鏡。
4. 蛋白質(zhì)結(jié)晶一旦晶核形成,晶體生長正式開始。對低分子量的化合物而言,新分子會逐步結(jié)合到正在生長的晶體表面。這是由于這些位置的結(jié)合能比較大,相對于分子結(jié)合到平滑的表面。這些步驟要么由晶系缺陷造成,要么發(fā)生在表面隨機形成的晶核。