采用 Profinity eXactTM融合標簽表達系統(tǒng)純化無標簽的重組蛋白

親和標簽已成為后基因組學時代純化重組蛋白常用手段。此方法無需了解蛋白質(zhì)的生化特性或生理活性，就可通過帶標簽的重組融合蛋白選擇性地與層析基質(zhì)上的配體結(jié)合，從而得以純化任何蛋白質(zhì)。此方法與常規(guī)的層析方法不同之處在于，針對不同的蛋白質(zhì)需要開發(fā)特定的配體和方法。采用保護蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能完整性的溫和條件，已成功地通過一步親和層析從粗提物中純化出了多種重組蛋白，純度達 90％以上。（Arnau et al. 2006）。 

然而，對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究和治療或診斷試劑的應用，我們期望獲得天然的無標簽蛋白，以避免親和標簽所帶來的潛在干擾（Arnau et al. 2006, Bucher et al. 2002）。因此需要用蛋白酶剪切純化的融合蛋白，然后再經(jīng)親和層析去除蛋白酶和切除的融合標簽從而獲得天然純品。然而針對某些特定的融合蛋白，此剪切過程比較困難。另一體系采用內(nèi)含肽對融合蛋白進行自我剪切從而獲得天然 N端的重組蛋白。然而，這一自我剪切過程很緩慢并大大依賴于內(nèi)含肽與目的蛋白連接處的氨基酸序列（ Waugh 2005），因此限制此方法應用于重組蛋白的純化。  
Profinity eXact純化介質(zhì)是 Profinity eXact融合標簽系統(tǒng)的一部分，該系統(tǒng)可在 E.coli中高表達重組蛋白并對其進行純化。它將親和層析純化和標簽的去除整合成一步，從而解決了親和層析純化的重組融合蛋白到獲得天然重組蛋白的技術(shù)壁壘 （ Ruan et al, 2004）。將目的蛋白的編碼序列克隆至 Profinity eXact pPAL7表達載體的 Profinity eXact標簽的下游，從而產(chǎn)生了 N端帶有標簽的重組蛋白（圖 1）。固定在 Profinity eXact純化介質(zhì)上的突變的絲氨酸蛋白酶選擇性地與 Profinity eXact標簽結(jié)合（Kd< 100 pM）(Ruan et al, 2004)。通過結(jié)合后的清洗過程去除宿主細胞的雜質(zhì)，然后加入 F－或 N3－地誘發(fā)了親和標簽與目的蛋白之間的酶切，從而導致 Profinity eXact標簽被固定的蛋白酶滯留在介質(zhì)上，僅預期的重組蛋白從層析柱上洗脫，且無需其它處理即可將其進行下游應用。 
   
圖 1 Profinity eXact pPAL載體 
我們利用 Profinity eXact融合標簽系統(tǒng)純化了多種不同分子量的蛋白，并用各種參數(shù)測試了它的性能。數(shù)據(jù)顯示了該新型純化系統(tǒng)的有效性，包括選擇性的捕獲帶標簽蛋白、親和標簽柱上的剪切，及整體有效并簡便的純化過程。對用 Profinity eXact純化介質(zhì)裝填的 Profinity eXact mini spin層析柱和 Bio-ScaleTM層析柱進行柱性能評價，評價參數(shù)有多次純化和再生循環(huán)后介質(zhì)的穩(wěn)定性及在變性劑如尿素存在時介質(zhì)的功效。 

結(jié)論 
我們已利用 Profinity eXact融合標簽系統(tǒng)純化了多種無標簽的重組蛋白。該系統(tǒng)是目前僅有的采用通常操作手段僅一步層析過程，即可獲得*去除標簽的重組蛋白。通常的親和標簽純化及去除需要條件優(yōu)化，并且很費時，而利用 Profinity eXact系統(tǒng)制備無標簽、N端無任何其它殘基的重組蛋白只需大約 1小時。該親和介質(zhì)較為穩(wěn)定，可多次用于目的蛋白的純化，從而節(jié)約了成本。同時，我們證實了 Profinity eXact純化介質(zhì)的結(jié)合和柱上剪切特性可在高達 4 M尿素的情況下得以實現(xiàn)。因此，該系統(tǒng)適用于純化以不溶的聚集體形式存在的重組蛋白。Profinity eXact融合標簽系統(tǒng)的有效性和一致性將使其成為獲得高產(chǎn)率無標簽重組蛋白的通用平臺。