PTEN通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路下調(diào)內(nèi)皮素受體B抑制內(nèi)皮素-1引起的肝星狀細(xì)胞活化

李乃樹

南方醫(yī)科大學(xué)

摘要：[背景]肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝臟疾病之后反復(fù)的創(chuàng)傷愈合與瘢痕修復(fù)過程,其主要病理生理學(xué)特征是細(xì)胞外基質(zhì)(Extrcellular matrix,ECM)的生成與降解失衡,引起ECM的大量沉積,zui終導(dǎo)致肝纖維化。肝纖維化的過程可逆,不能有效控制肝纖維化必然導(dǎo)致肝硬化,zui終出現(xiàn)肝癌甚至肝功能衰竭。肝纖維化是多種細(xì)胞與細(xì)胞因子相互作用的結(jié)果,其中,肝星狀細(xì)胞(hepatic slate cells, HSCs)已經(jīng)被證實為引起肝纖維化的主要細(xì)胞,其活化和增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵事件。正常情況下,HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài),主要功能為儲存Vitamin-A,因此也被稱為儲脂細(xì)胞。當(dāng)肝臟受損傷時,HSCs在多種炎癥反應(yīng)因子的作用下被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生大量ECM,導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。HSCs激活的過程受多種信號物質(zhì)及信號通路的調(diào)控,但其具體機(jī)制仍未被*闡明。內(nèi)皮素—1(endothelin-1,ET-1)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)的一種調(diào)節(jié)血管收縮的活性肽,在正常個體的血管張力調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用。同時,ET—1也與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括刺激細(xì)胞的發(fā)育和增殖、參與創(chuàng)傷愈合反應(yīng)和組織纖維化過程。近年來,針對ET—1與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,尤其是HSCs的活化和增殖方面已開展了廣泛的研究。正常情況下,肝組織內(nèi)肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和HSCs可以產(chǎn)生ET—1,在肝臟損傷的情況下,HSCs成為ET—1分泌的主要細(xì)胞,且ET—1通過作用于HSCs表面表達(dá)的ET受體(endothelinreceptor,ETR)啟動HSCs的激活程序。ET—1可通過作用于HSCs上的ET—1受體,即ETAR(endothelin A receptor,ETAR)或ETBR(endothelin B receptor, ETBR),引起HSCs活化增殖和DNA合成,從而促進(jìn)膠原與蛋白多糖合成增加、纖維組織增生、損傷修復(fù)的加速。眾多的研究結(jié)果顯示ET—1在肝纖維化的病理生理過程中發(fā)揮重要作用,但ET—1作為一種調(diào)節(jié)因子在HSCs的激活、增殖及ECM沉積的過程中作用的確切機(jī)制仍未*明確。10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因(phosphate and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)作為一種抑癌基因,它同時具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性,PTEN基因的缺失或突變已在包括原發(fā)性肝癌在內(nèi)的許多終末期腫瘤中發(fā)現(xiàn)。近年來,關(guān)于PTEN的研究已經(jīng)從肝臟腫瘤領(lǐng)域轉(zhuǎn)移至肝臟非腫瘤性疾病,且已有文獻(xiàn)報道PTEN與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),纖維化肝組織中PTEN的表達(dá)下降,PTEN的表達(dá)隨著肝纖維化進(jìn)展而減少,且在體外環(huán)境中PTEN基因的表達(dá)與HSCs的活性及增殖能力成負(fù)相關(guān)。因此,調(diào)節(jié)PTEN在HSCs中的表達(dá)可能會影響HSCs的活化及增殖進(jìn)而影響肝纖維化的進(jìn)展綜上所述,ET—1可以啟動HSCs的活化程序,但是PTEN可以通過一定的信號通路抑制HSCs的活化過程,二者在HSCs活化過程中的作用及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。[目的]為了進(jìn)一步探討ET—1及PTEN在HSCs激活方面的作用,本實驗通過研究過表達(dá)PTEN的HSC-T6在外源性ET—1的刺激下所產(chǎn)生的效應(yīng),并應(yīng)用PI3K/AKT信號通路的特異性抑制劑LY294002模擬PTEN對PI3K/AKT信號通路的阻斷作用,探討PTEN是否能夠通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路下調(diào)ETBR的表達(dá)從而抑制ET—1引起的HSCs的激活。[方法]①、實驗分組本實驗按以下分組方式進(jìn)行：1、P組,PTEN轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組;2、V組,空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組；3、PBS+ET-1空白對照組；4、L+V組,空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1+L Y294002組;5、PBS+ET-1+LY294002組。②、細(xì)胞培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自廣東科學(xué)院,細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎臺牛血清、100 IU/m青霉素、和100mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,并在37℃含5%C02的培養(yǎng)箱中孵育。③、細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前24小時,指數(shù)級生長的HSC-T6以每孔2×105的濃度接種于6孔板,待細(xì)胞鋪滿70%—80%的培養(yǎng)孔時開始轉(zhuǎn)染。PTEN及空載PTEN的vector采用lipofectamine 2000,根據(jù)試劑盒說明,以zui終100nM的濃度轉(zhuǎn)染進(jìn)入HSC—T6,并設(shè)置PBS為空白對照組。轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后各組加入10-7mol/L ET-1,12h在L+V組及L+PBS組加入50uM/L LY294002, ET-1作用48h后檢測各指標(biāo)的蛋白質(zhì)及基因水平的表達(dá)。④、蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)a-SMA, ETBR及ETAR的蛋白表達(dá)水平采用western blot方法檢測。經(jīng)ET-1作用48h后,收集細(xì)胞樣品,加入相應(yīng)體積的含有1%Nonidet P-40,0.5% sodium deoxycholate,0.1%sodium dodecyl sulfate和蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液,冰上放置30 min,然后4℃,12 000 r/min離心10 min,吸出上清,得到總蛋白樣品。樣品蛋白質(zhì)采用BCA蛋白定量試劑盒定量。調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度使其接近,保證每個樣品孔蛋白質(zhì)上樣量一致.蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(MILLIPORE)。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉1h后,加入一抗4℃過夜。在此過程中所用到的抗體a-SMA (1;1000 dilution, Santa Cruz Inc), ETBR (1:1500 dilution; Santa Cruz Inc.), ETAR (1; 1500 dilution; Santa Cruz Inc), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (1:1000 dilution; Shanghai Sangon Biotech)。取出PVDF膜,經(jīng)洗滌后,再加入HRP標(biāo)記的二抗(1:4000 dilution,Fude Biotech),室溫下孵育1h。每步反應(yīng)結(jié)束均用PBST洗滌3次,每次10 min。zui后用ECL化學(xué)發(fā)光3-5min,使用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜。結(jié)果以目的蛋白與GAPDH吸光度的比值表示。⑤、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)ET-1作用后48h,采用Trizol(Invitrogen)試劑盒,按說明提取細(xì)胞總RNA。將RNA提取物1ug,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并置于-80℃保存?zhèn)溆?。建?0ul的PCR反應(yīng)體系包括：cDNA,上下游引物、2x SYBR Green qPCR SuperMix、以及dH2O。采用LightCycler 480IISystem進(jìn)行PCR擴(kuò)增,建立zui適的PCR反應(yīng)體系,擴(kuò)增相應(yīng)的產(chǎn)物。β-actin被用作內(nèi)參。ETAR引物序列：上游5’-TCTGATGACCTC GGTCCC-3’,下游5’-GTTCATGCTGTCCTTATGGCT-3’,ETBR引物序列：上游5’-AATTACGATGGACTACAAAGGAAGTTA-3’,下游5’-GCAAGCAGAAATAGA AACTGAATAGC-3’.β-actin引物序列：上游5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’,下游5’-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3’。[統(tǒng)計學(xué)分析]所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]1、ET—1作用后各組各指標(biāo)的變化①、ET—1作用后各組α-SMA的表達(dá)變化Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7 mol/L外源性ET—1作用于各組HSC—T6后,P組α-SMA的相對表達(dá)量為(0.35±0.01),明顯低于V組(0.46±0.01)及PBS組(0.46±0.01)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②、ET—1作用后各組ETBR的表達(dá)變化Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各組HSC—T6后,ETBR蛋白的相對表達(dá)量在P組為(0.42±0.01)顯著低于V組(0.85±0.01)及PBS組(0.83±0.01),(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各組細(xì)胞后,ETBR mRNA的相對表達(dá)量在P組為(0.63±0.06)顯著低于對照組(V組：1.61±0.13,PBS組：1.50±0.03)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。③、ET—1作用后各組ETAR的表達(dá)變化Western blot檢測結(jié)果顯示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各組HSC—T6后,ETAR蛋白的相對表達(dá)量在P組為(0.22±0.01)與V組(0.22±0.01)及PBS組(0.22±0.01)無明顯差異。qRT-PCR結(jié)果顯示,10—7mol/L外源性ET—1作用于各組細(xì)胞后,ETAR mRNA的相對表達(dá)量在P組為(0.46±0.01),V組(0.46±0.01),PBS組(0.46±0.01), (p>0.05),各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2、LY294002作用后各組各指標(biāo)的變化①、LY294002作用后各組α-SMA的表達(dá)變化Western blot檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,α-SMA的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.34±0.01,0.34±0.01),顯著低于V組及PBS組α-SMA的表達(dá)(p<0.05),但與P組α-SMA的表達(dá)無顯著差異(p>0.05)。②、LY294002作用后各組ETBR的表達(dá)變化Western blot檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETBR蛋白的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.43±0.01,0.44±0.01),顯著低于V組及PBS組(p<0.05),但與P組ETBR蛋白的相對表達(dá)無顯著差異(p>0.05)。qRT一PCR結(jié)果顯示,ETBR mRNA的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.65±0.02,0.64±0.01),顯著低于V組ETBR mRNA的表達(dá)(p<0.05),但與P組ETBR的表達(dá)無顯著差異(p>0.05)。③、LY294002作用后各組ETBR的表達(dá)變化Western blot檢測結(jié)果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETAR蛋白的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.22±0.02,0.23±0.01),與P組、V組及PBS組ETAR蛋白的相對表達(dá)量無明顯差異(p>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,ETAR mRNA的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.45±0.02,0.46±0.01),與P組、V組及PBS組ETAR mRNA的相對表達(dá)量無明顯差異(p>0.05)。[結(jié)論]PTEN通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路下調(diào)ETBR而非ETAR的表達(dá)從而抑制ET—1引起的HSCs的活化。 還原

關(guān)鍵詞：肝纖維化; 肝星狀細(xì)胞; PTEN; 內(nèi)皮素-1;

導(dǎo)師：林建華;

分類號：R575.2