小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型

缺血再灌注損傷，即缺血器官、組織重新獲得血液供應，不僅不能使組織、器官功能恢復，反而加重了功能代謝障礙及結構破壞。對麻醉動物的肝中葉和肝左葉的門靜脈和肝動脈進行阻斷和再通，由于肝臟中葉和左葉血流的阻斷和再通，引起肝臟中葉和左葉明顯的再灌注損傷。肝臟缺血過程中由于肝細胞內ATP迅速耗盡，導致乳酸酮體等的堆積，及線粒體氧化磷酸化功能低下，引發(fā)代謝性酸中毒，缺血過程中細胞缺氧使ATP含量下降，導致肝細胞內外Ca2 +重新分布，即Ca2 +內流，引起線粒體的損傷。再灌注過程中由于氧自由基的爆發(fā)性增多，中性粒細胞的聚集，kupffer細胞的激活，細胞凋亡及其他多種細胞因子的作用，使得肝細胞膜損傷，內皮細胞損傷及肝臟微循環(huán)障礙等導致肝臟功能代謝障礙及結構破壞。

    1.實驗動物

SPF級Balb/C小鼠，雄性，周齡為4w~6w，體重為20g~22g。

2.實驗分組：

    實驗分六組：正常對照組、模型組、陽性藥組、受試藥組三個劑量組，每組15只動物。

3.實驗周期

    0h、3h、6h、12h、24h、72h

    4.建模方法

1 小鼠術前12 h禁食，自由飲水。

2 3%戊巴比妥鈉80mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后將小鼠平躺在手術臺上膠帶固定四肢，將小鼠腹部術去毛，用碘酒和75％乙醇術區(qū)消毒。

3 取腹正中切口25px，打開腹腔，小心分離出肝臟左、中葉之肝蒂（左、中葉肝臟供血的門靜脈和肝動脈）。

4 用無創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動脈，使約70%的肝臟缺血，以防止發(fā)生嚴重腸系膜靜脈淤血。0.5min后，與非阻斷的右葉相比，肉眼可見阻斷葉明顯變白，說明阻斷成功，用止血鉗夾閉皮膚切口臨時關閉腹腔，同時將小鼠放在37℃恒溫加熱墊上保溫。

5 完成持續(xù)缺血60min后，重新打開腹腔，迅速取出血管夾，恢復缺血肝血流，0.5min左右可見缺血區(qū)肝臟由白色逐漸恢復為鮮紅色表明再灌注成功，逐層縫合腹腔肌肉和皮膚關閉腹腔，完成手術。待小鼠清醒后放回飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，密切關注小鼠的狀態(tài)及生存狀況并做好記錄。

6 術后分別于再灌注0h、3h、6h、12h、24h及72h麻醉小鼠，摘眼球取血，室溫靜置2h后于4℃3000r離心10分鐘提取血清，放入-80冰箱凍存。采用全自動生化分析儀檢測血清中ALT（谷丙轉氨酶）、AST（天門冬氨酸氨基轉移酶）的水平。同時統(tǒng)一取肝左葉組織1．125px×25px×0．50px留作病理標本或分生標本。

  5.模型評價

1 分別檢測術后0h、3h、6h、12h、24h及72h小鼠血清中ALT（谷丙轉氨酶）、AST（天門冬氨酸氨基轉移酶）的水平。

2 統(tǒng)一取肝左葉組織1．125px×25px×0．50px于4%多聚甲醛溶液中固定24h后脫水，包埋，進行石蠟切片后行HE染色，tunel染色。作壞死評分。肝小葉結構嚴重破壞，網狀纖維支架塌陷，肝細胞壞死，空泡變樣，肝細胞索、肝竇充血腫脹，邊界不清，周圍有炎性細胞浸潤。

肝臟缺血損傷評分：

0分：無肝細胞損傷

1分：輕度損傷，特點為細胞質空泡化，病灶核固縮

2分：中度損傷，血竇膨脹，細胞溶質空泡化，細胞邊界模糊

3分：中度到重度損傷，凝固性壞死，大量血竇膨脹，紅細胞滲出到肝鎖，嗜伊紅細胞增多，中性白細胞著邊（附著于血管壁）

4分：嚴重壞死，失去肝臟結構，肝索崩解，出血，嗜中性粒細胞滲入 

3 細胞因子的檢測

肝臟損傷后，血清中TNFα、IFNγ、IL-2、IL-6、ICAM1等細胞因子的表達顯著升高，可以用ELISA 法檢測。

6 注意事項

6.1 分離肝門時用棉簽分離，可避免對肝臟的損傷

6.2術前禁食有利于手術進行

6.3阻斷血流要一次成功，否則會造成缺血預處理，減輕損傷程度

6.4取材時鑷子不要損傷肝臟