免疫組化非特異性染色的消除方法

非特異性染色的主要因素 組織的非特異性染色的機理很復雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點： （1） 一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去 （2） 抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。 （3） 除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如 Forssman 氏抗原），可與組織中特異 性抗原以外之之相應抗體結合。 （4） 從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體， 以致容易混淆。 （5） 抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正 常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。 （6） 熒光素不純，標本固定不當?shù)取?二消除非特異性染色的方法 消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當?shù)姆椒?，常用的方法有以下幾種： （一） 動物臟器粉末吸收法 常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg, 在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min， 1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色 應作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去 上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。 肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組 織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。 用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據(jù) Hiramotos 氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用 生理鹽水洗2～3次，12000r/min, 10min 離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能*達到目的，京極 方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有 必要再吸收一次。 肝粉的制法: （1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組 織的脂肪。 （2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。 （3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血 色止，每次完畢先用2000r/min 離心沉淀15 min 后，再除去上清液。 （4）zui后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干 （過夜）。 （5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。 （二）透析法 熒光素如 FITC 分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。 （1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。 （2）浸入0.02mol/pH 7.1～7.4的 PBS 中（懸于大于標記物體積約50～100倍的 PBS 內），在4℃中透析，每 日更換3～4次 PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。 （三）葡聚糖凝膠 G-50柱層析法 除游離熒光素可用2×46cm 柱層析法，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～ 10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入 PBS 少許，關閉下口，停留30～40min ，使游 離熒光充分進入細篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移 行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越 來越大，熒光抗體zui先流出，分前、中、后三部分收集，測 F/P 比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液 用20%磺基水楊酸測定蛋白（發(fā)生沉淀反應），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋 白和熒光素后，此層析柱即可再用。若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前 透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未*洗脫時即出現(xiàn) NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫 液出現(xiàn)蛋白時，即進行收集，之后出現(xiàn) SO4++（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀）。zui后是 NH4+，（用納氏 試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無 SO4++及 NH4+后可再用。如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm 的 柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml 熒光抗體。 （四）DEAE 纖維素柱層析法 標記過多或過少熒光素的抗體分子可用 DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱， 洗脫、再生方法等與提純 IgG 方法相同。裝柱所需 DEAE-纖維素量以干重每克交換20～50mg 標記蛋白量 為宜。 常用梯度洗脫法如下： （1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，標記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB 洗脫，洗出無色或淡 綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強度洗脫液，分別洗脫和收集： 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。 將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其 F/P 比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB 洗脫液280nm 光密度高峰 管合并，濃縮保存?zhèn)溆?。因這部分非特異性染色熒光zui少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。 （2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續(xù)增加 NaCl 的濃度至 2.0mol/L 洗脫完。經(jīng)過 DEAE-纖維素層析后的 標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處 理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。 （五）熒光抗體稀釋法 先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界 濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。 （六）純化抗原法 用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價特異性抗體的zui主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法） 和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關專著。 （七）純化抗體法---免疫吸收法 例如抗 IgA 血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型 IgA（ SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與 IgG 呈交叉反應，為此需要吸收，常采用純化的人 IgG 戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下： 1．人 IgG 聚合物的制備 在5ml 含40mg/ml 人 IgG 的0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛 溶液1ml，邊加邊攪，5min 即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min 后，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液反復洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人 IgG 聚合物懸液。 2．免疫吸收法 將待吸收的抗 SIgG 血清加入待量 IgG 聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉淀，上清 液即稀釋1倍的純化抗 SIgA 血清。如用 IgG 聚合物作少量分次吸收，其效果更好。 （八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法 用0.01%伊文氏藍的0.01mol/L pH7.2PBS 稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異 性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存 于4℃，用前再稀釋至0.01%用以和然釋熒光抗體。此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白 封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。