原代肝細(xì)胞培養(yǎng)方法總結(jié)

1、肝細(xì)胞培養(yǎng)液的組成（以100ml培養(yǎng)液為例）：
DMEM90ml，10%胎牛血清10ml，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子1-2ug，雙抗（100乘）1ml，胰島素500U/L、地塞米松0.4mg/L
關(guān)于培養(yǎng)液添加內(nèi)容的解釋：
肝細(xì)胞培養(yǎng)液中是否要添加肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子
重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(r—hHGF）是zui強(qiáng)的促肝細(xì)胞分裂劑，在一定劑量范圍內(nèi)，r—hHGF與肝細(xì)胞DNA的合成有明顯的量效關(guān)系。
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的劑量問題：1ng/ml r-hHGF即可引起DNA合成顯著增加；10ng/ml時(shí)DNA合成效應(yīng)zui大，繼續(xù)增加r-hHGF的劑量會(huì)出現(xiàn)抑制效應(yīng)。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可觀察到，r-hHGF5ng/ml的刺激效應(yīng)與10ng/ml的相差無幾。這提示我們，為了節(jié)省試劑，在以后的實(shí)驗(yàn)中可采用5ng/ml的劑量。Strain等研究證明 ]，從人血漿中提取并純化的hHGF刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞合成DNA的半zui大劑量為1—2 ng／ml(1O一20 pmol／L)
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用時(shí)間的問題;表現(xiàn)為r-hHGF作用24小時(shí)，DNA 合成量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），48小時(shí)作用達(dá)zui高（P＜0.001），隨后開始下降，至96小時(shí)下降到相當(dāng)于24小時(shí)的水平。（肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激大鼠離體肝細(xì)胞DNA合成的劑量一與時(shí)間一效應(yīng)）
青霉素100u/ml,鏈霉素100ug/ml：防止污染
胰島素10-8mol/L，地塞米松10-6mol/L促進(jìn)貼壁
組織塊法肝細(xì)胞分離：
采用胰酶、膠原酶兩步消化法和低速多次離心法進(jìn)行肝細(xì)胞分離。將出生后第3天的SD大鼠斷頭處死放入750ml/L乙醇中消毒10min，無菌采取肝，置冰冷PBS中，撕去肝包膜，剪碎后加入0.5mg/L的胰酶中37℃振蕩消化20min，棄去上清后，再用2mg/L的IV型膠原酶37℃振蕩消化20min，用含10% 胎牛血清的DMEM-HG終止消化，吹打2min，靜置使肝組織塊沉于消化瓶的底部，取上清收集細(xì)胞懸液，以800r／min離心5 min，棄上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度以5×10／ml接種于50ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37"C、5 %C02、飽和濕度靜置培養(yǎng)。用200目孔徑網(wǎng)篩過濾，細(xì)胞懸液在4℃條件下800r/min離心3min，反復(fù)離心3次。沉積的細(xì)胞用含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5*105/ml,臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定肝細(xì)胞活力。將調(diào)整好密度的細(xì)胞接種在膠原包被的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)后換液，去掉紅細(xì)胞。采用過碘酸-雪夫反應(yīng)鑒定肝細(xì)胞。
2.取肝細(xì)胞注意事項(xiàng)
取大鼠肝臟細(xì)胞前需要禁食12h
非灌流分離肝細(xì)胞法，該法直接將離體肝臟置于冷的培養(yǎng)基中，切碎，加入溶解酶破換肝細(xì)胞間連結(jié)，再經(jīng)過振動(dòng)、沉淀，zui后在上清液中得到游離的肝細(xì)胞。（游離肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在肝臟毒理學(xué)研究中的應(yīng)用）
洗滌液D-hanks液，用眼科剪剪成1mm3左右的碎塊，使其成糊狀。
3、肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中造成肝細(xì)胞損傷的問題
原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞的代謝功能較其他細(xì)胞更為敏感，本實(shí)驗(yàn)中由于肝細(xì)胞分離時(shí)細(xì)胞膜完整性的損傷，細(xì)胞需要在體外逐漸的修復(fù)，在培養(yǎng)第3天細(xì)胞活力（MTT實(shí)驗(yàn)A值z(mì)ui大）達(dá)到高峰，合成和分泌功能完好，LDH漏出也較低，細(xì)胞達(dá)到*狀態(tài)，與其他研究結(jié)果一致。（全反式視黃酸對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞鐵代謝的影響）
4、臺(tái)盼藍(lán)染色的濃度
0.4的臺(tái)盼藍(lán)，達(dá)90%以上用于實(shí)驗(yàn)（兩步灌流法）（肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激大鼠離體肝細(xì)胞DNA合成的劑量一與時(shí)間一效應(yīng)）
 

Trypan blue （臺(tái)盤蘭）排斥實(shí)驗(yàn)：
細(xì)胞懸液0.1ml加入0.4% Trypan blue生理鹽水溶液0.1ml,混勻后滴在血球記數(shù)板上。存活率=不著色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X100%

5、取肝細(xì)胞注意事項(xiàng)
取大鼠肝臟細(xì)胞前需要禁食12h
非灌流分離肝細(xì)胞法，該法直接將離體肝臟置于冷的培養(yǎng)基中，切碎，加入溶解酶破換肝細(xì)胞間連結(jié)，再經(jīng)過振動(dòng)、沉淀，zui后在上清液中得到游離的肝細(xì)胞。（游離肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在肝臟毒理學(xué)研究中的應(yīng)用）
洗滌液D-hanks液，用眼科剪剪成1mm3左右的碎塊，使其成糊狀。
6、肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中造成肝細(xì)胞損傷的問題
原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞的代謝功能較其他細(xì)胞更為敏感，本實(shí)驗(yàn)中由于肝細(xì)胞分離時(shí)細(xì)胞膜完整性的損傷，細(xì)胞需要在體外逐漸的修復(fù)，在培養(yǎng)第3天細(xì)胞活力（MTT實(shí)驗(yàn)A值z(mì)ui大）達(dá)到高峰，合成和分泌功能完好，LDH漏出也較低，細(xì)胞達(dá)到*狀態(tài)，與其他研究結(jié)果一致。（全反式視黃酸對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞鐵代謝的影響）
7、Pereol1分離液：Pereol1分離液以9份Percoll原液，加入1份10 X PBS，制成緩沖的Percoll液，再用1 X PBS調(diào)整Percoll液密度為1．08—1．09 kg／L。若肝細(xì)胞的活率在90％以下，則加用Percoll細(xì)胞分離液進(jìn)一步純化。8 mL肝細(xì)胞懸液懸浮于密度為1．08—1．09 kg／L的20 mL Percoll液上，5 000 r／min離心5 min，棄上清，PBS清洗肝細(xì)胞1次，500 r／min，3 min。
肝細(xì)胞的接種 活力在90％ 以上的肝細(xì)胞按1 X l05密度接種兩組6孔板，每孔加入3 mL Hepa．toZYME—SFM肝細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃ 、5％co2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)4—6 h待肝細(xì)胞貼壁后即更換培養(yǎng)液，其后每3 d換液1次。（長(zhǎng)期培養(yǎng)的大鼠原代肝細(xì)胞功能和形態(tài)學(xué)觀察）
8.（1）培養(yǎng)瓶紫外過夜，高壓后的1×PBS 10ml備用
（2)計(jì)算膠原溶液濃度：查文獻(xiàn)得膠原濃度為10μg/cm2（儲(chǔ)存濃度為4mg/ml),一般中等大小的培養(yǎng)瓶為25cm2，計(jì)算[(10×1/1000 mg/cm2)×25cm2]/4mg/ml可得出每個(gè)培養(yǎng)瓶需要的膠原量
(3)先在高壓后15ml離心管內(nèi)加入5ml 1×PBS，再用槍吸取計(jì)算好的膠原用量，注入PBS里，混勻
(4)將配好的膠原溶液緩緩注入培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶水平放在超凈臺(tái)里，可用紫外照，15－30min后，將PBS貼壁吸出，盡量吸干凈，再將培養(yǎng)瓶放入超凈臺(tái)里照紫外，等膠原干后即可使用。
(5)如果放在超凈臺(tái)里保存，一周內(nèi)仍可有效。注：1、所有操作均在超凈臺(tái)里無菌操作2、膠原為collage type I(Upstate）液態(tài)濃度為4mg/ml，無菌。3、PBS新鮮配置，高壓后放在超鏡臺(tái)里冷卻至室溫
(6)膠原一定要充分混勻，否則鋪板時(shí)凸凹不平
(7)膠原包被后，不要用紫外線照，會(huì)破壞膠原結(jié)構(gòu)，注意無菌操作即可。2。使用前，用溫?zé)岬牟缓宓呐囵B(yǎng)基洗一次后，再用。

膠原包被后應(yīng)該晾干，因?yàn)槟z原一般是用0.01%醋酸配制，如果包被后沒有自然晾干，會(huì)使培養(yǎng)基變酸。自然晾干后可以保證膠原*吸附在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上，而且多余的醋酸可以揮發(fā)，不會(huì)影響培養(yǎng)基的PH值。別忘了加分

我用培養(yǎng)皿，包被后超凈臺(tái)內(nèi)開蓋開紫外燈~

膠原用三蒸水溶即可，4mg用16ml溶，終濃度250ug/ml，4度保存用時(shí)每10ml培養(yǎng)液加0.1ml，配成2.5ug/ml含膠原培養(yǎng)液來包被包被后敞開在紫外燈下照射一小時(shí)即可.
9.肝細(xì)胞純化采用差速離心法：800轉(zhuǎn)，4℃，3min
10.鑒定我采用的是糖原染色和免疫熒光（ck18）