多種細(xì)胞的培養(yǎng)方法

HePG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞的傳代：
HePG2細(xì)胞屬人肝腫瘤的恒生細(xì)胞株，L-02細(xì)胞則是人胎肝細(xì)胞株，二者所使用的培養(yǎng)基可以是一樣的，即zui常見的DMEM。一干使用低糖的。
細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)既要傳代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度預(yù)熱，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗兩遍后，每個(gè)中號(hào)培養(yǎng)瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根據(jù)自己培養(yǎng)瓶的大小而定，原則就是能夠蓋滿瓶底。加入胰酶以后，為使酶的活性zui大，將培養(yǎng)瓶蓋擰緊后放回培養(yǎng)箱中，3分鐘左右即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。如果在室溫情況下消化，時(shí)間相應(yīng)加長(zhǎng)，可以在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞界限已十分清楚，即已分離為單個(gè)細(xì)胞，且有少量細(xì)胞漂起，則要終止消化了。
16HBE細(xì)胞株的傳代方法：
鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70-80%，準(zhǔn)備傳代。常規(guī)開紫外照射超凈臺(tái)20分鐘，同時(shí)把含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、0。25%胰酶、PBS放置37度培養(yǎng)箱中孵育。20分鐘后開始傳代。先棄掉舊培養(yǎng)液，加PBS洗一次，然后加0。25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培養(yǎng)瓶）細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞變圓，然后將培養(yǎng)瓶放置37度二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3分鐘左右（當(dāng)然時(shí)間是隨機(jī)的，比如：新配的胰酶作用時(shí)間短一些，配制時(shí)間長(zhǎng)的胰酶作用時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些，當(dāng)然要不斷地鏡下觀察），待細(xì)胞大部分消化下來（大部分細(xì)胞呈流沙狀脫離瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打瓶壁上殘留的細(xì)胞，并將已消化下來的細(xì)胞吹打均勻，然后吸入離心管中1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，然后棄掉上清，用手指將離心管中的細(xì)胞彈打均勻，加新培養(yǎng)基，吹打均勻，分至3個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶平放，小心移入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日觀察。

胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901的培養(yǎng)：細(xì)胞傳代時(shí)不能長(zhǎng)的太滿,70%-80%就可以傳了.實(shí)驗(yàn)前先把紫外燈打開照30分鐘,然后再把鼓風(fēng)機(jī)開10分鐘,同時(shí)把培養(yǎng)液和胰酶放入37度水浴箱中,千萬記住不要蓋上水浴箱的蓋子.傳代時(shí),我一般把培養(yǎng)瓶口過一下火,就直接把培養(yǎng)液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等細(xì)胞變圓,細(xì)胞間空隙加大就直接把培養(yǎng)液到去,不用離心,然后再吹打,雖說要輕柔,但很難吹打成單細(xì)胞懸液,所以稍用力也沒有關(guān)系.雖然操作不規(guī)范,但節(jié)省時(shí)間,細(xì)胞也沒有被污染.

AAV-293細(xì)胞的傳代:
AAV-293細(xì)胞較喜歡成團(tuán)生長(zhǎng),比較嬌嫩,怕冷,傳代時(shí)不要一次從二氧化碳培養(yǎng)箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出來傳就可以了,否則細(xì)胞很容易死掉.細(xì)胞在50-60%傳代,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài).
用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分鐘左右,棄去胰酶.觀察培養(yǎng)瓶是否有針孔樣縫隙,如有就可以加入培養(yǎng)液吹打細(xì)胞.消化過久,對(duì)細(xì)胞損害很大,而且成團(tuán)很難吹打成單個(gè)細(xì)胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.輕輕放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng).



肺癌細(xì)胞（人類），其中絕大部分都是貼壁細(xì)胞，具體如：
（１）?。粒担矗梗ǚ蜗侔?br />（２）　ＮＣＩＨ４４６（小肺細(xì)胞癌）
（３）?。福埃保ǚ切》渭?xì)胞癌）
（４）?。危茫桑龋矗叮啊。ù蠹?xì)胞肺癌）

在消化傳代過程中，步驟基本一致：
吸去舊的培養(yǎng)液－＞用Ｈａｎｋｓ'（１Ｘ）清洗一兩次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞大部分變圓時(shí)，回到超靜臺(tái)－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細(xì)胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞全部懸浮起來－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞zui后再補(bǔ)充加入一定量新的培養(yǎng)液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ?。保埃ァ。疲拢樱?br />注意：　吹細(xì)胞時(shí)盡量多吹邊角兒，此處細(xì)胞生長(zhǎng)的多．另外吸出細(xì)胞前要混勻．
另注：消化液的配制方法：
Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na
prepared with 2.5g Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS
小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）：
吸棄原培養(yǎng)液-->PBS洗一兩次-->加入400ul0.125％胰酶（原代加0.05% EDTA）消化-->轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)盤，保證整個(gè)盤面都被trypsin液潤(rùn)過->吸棄trypsin后37度消化3min-->以*培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸鈣-->吸打（槍的吸力調(diào)至zui小），1：10接種，前后左右搖晃培養(yǎng)盤，細(xì)胞均勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（10%CO2 ,37度）

MDBK（牛腎細(xì)胞）類型：貼壁細(xì)胞
來源：購(gòu)自武漢病毒所細(xì)胞保存中心
由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心繁殖保存
傳代步驟：
棄去舊的生長(zhǎng)液-->用無鈣鎂水(CMF)沖洗貼壁細(xì)胞數(shù)次(視細(xì)胞瓶的大小,3--5次)-->剩少許CMF,滴入 ATV 2--3滴-->搖勻細(xì)胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒個(gè)地方-->放入37度二氧化碳溫箱中3--5min消化-->棄去ATV,加入生長(zhǎng)液,拍打吸吹下細(xì)胞-->鏡下觀察-->分瓶-->作好記號(hào),放入37度二氧化碳溫箱生長(zhǎng)
細(xì)胞特點(diǎn):該細(xì)胞生長(zhǎng)力強(qiáng),而且快速一般24h就可以張到80%,48h不傳就會(huì)變的很老,所以該細(xì)胞傳時(shí)要勤點(diǎn);我感覺MDBK還是很好傳的,比以前我傳的ST、Vero細(xì)胞等要好傳一些，且不那么容易死亡，所以是我的一個(gè)比較好的選擇！該細(xì)胞適合接種皰疹病毒（如：偽狂犬病毒）！

BHK-21：棄除舊的培養(yǎng)液后---用緩沖液沖洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化約兩分鐘左右可以看到細(xì)胞像沙子一樣脫落-------趕緊倒掉胰酶加入含10%的牛血清培養(yǎng)液終止消化。但目前國(guó)內(nèi)能找到的BHK-21細(xì)胞大部分都有支原體感染，如果是好的BHK-21細(xì)胞能做到1比20的分種率。
補(bǔ)充一點(diǎn)關(guān)于BHK-21的培養(yǎng),先用少量胰酶沖洗一下,棄去,再用胰酶消化1min左右,效果會(huì)好一些

皮膚成纖維細(xì)胞和THP-1細(xì)胞：皮膚成纖維細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)的。THP-1細(xì)胞是懸浮的。
由于我們實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間也不是很長(zhǎng)，所以也只能說說自己平時(shí)的操作了。
先說皮膚成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底，也就是細(xì)胞與細(xì)胞之間沒有間隙時(shí)，就可以傳代了。一般十天左右傳一代。先吸棄舊培養(yǎng)液，用D-Hanks液洗兩遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后靜置兩分鐘左右，是能在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙且有一部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形后即可。吸去胰酶，加入含血清培養(yǎng)液，搖晃瓶子使培養(yǎng)液覆蓋瓶底就行了。因?yàn)檠蹇梢越K止胰酶的消化。然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫落。再分瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液。
THP-1細(xì)胞的傳代就比較簡(jiǎn)單了?？梢杂袃煞N傳代方法。如果鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)很好，沒有其它雜質(zhì)即細(xì)胞裂解物之類的，就可以采用直接傳代法。傳代前將細(xì)胞培養(yǎng)瓶直立一個(gè)半小時(shí)使細(xì)胞自然下沉。吸棄上層少量培養(yǎng)液約三分之一，將余下的培養(yǎng)液分成兩瓶，再分別補(bǔ)加培養(yǎng)液即可。如果鏡下觀察覺得培養(yǎng)液中有雜質(zhì)即可采用離心傳代法。如果細(xì)胞數(shù)目較多可以低速離心約600轉(zhuǎn)離心六分鐘，細(xì)胞可以沉淀下來而且可以去除細(xì)胞碎片之類的雜質(zhì)。如果覺得細(xì)胞數(shù)目不多比較寶貴，那就提高轉(zhuǎn)速可以1000轉(zhuǎn)離心六分鐘，這樣細(xì)胞損失很少但可能也有些雜質(zhì)會(huì)一起沉淀下來。離心后去除上清液，加入新的培養(yǎng)液吹打渾勻即可分瓶傳代了。
目前的方法就這些，希望對(duì)新手有所幫助

BHK－21的經(jīng)驗(yàn)：
吸出培養(yǎng)基，吸得越干凈越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培養(yǎng)箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之類得緩沖洗細(xì)胞并不必要，我都沒有洗，感覺應(yīng)該洗一下更好，但也更麻煩并增加了污染得可能性。如果細(xì)胞長(zhǎng)得太老，可以先加入1ml胰酶在細(xì)胞表面浸潤(rùn)一下就吸出來，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前預(yù)熱到37度。由于胰酶平時(shí)保存在4度，反復(fù)預(yù)熱對(duì)胰酶的活性不好，我的經(jīng)驗(yàn)是將胰酶進(jìn)行分裝，盡可能避免胰酶反復(fù)冷卻加熱。消化時(shí)間的選擇要根據(jù)實(shí)際情況決定，BHK－21還是比較好消化的，5－15min應(yīng)該足夠了，消化時(shí)間太長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞不利。可以在顯微鏡下觀察消化情況，必要時(shí)可以拍打培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞分散，消化結(jié)束后直接加入培養(yǎng)基即可，胰酶會(huì)被血親滅活。一般在T－25瓶中留7－8ml培養(yǎng)基培養(yǎng)。在90％單層細(xì)胞時(shí)，1：4傳代2天后可長(zhǎng)滿。如果使用的培養(yǎng)基偏堿先放在CO2培養(yǎng)箱中平衡。細(xì)胞生長(zhǎng)中注意觀察培養(yǎng)基顏色（加入酚紅作指示劑），如出現(xiàn)偏黃表明細(xì)胞代謝產(chǎn)酸較多，此時(shí)如細(xì)胞未長(zhǎng)滿應(yīng)更換部分或全部培養(yǎng)基以確保細(xì)胞狀態(tài)不受影響。