小鼠趨化因子CCL8檢測試劑盒(ELISA方法)

本試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法，用于體外定量分析小鼠血清、血漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清中CCL8的含量。預先包被的抗體和檢測相抗體都是近100%純度的CCL8親和純化多克隆抗體。檢測相抗體經(jīng)生物素標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CCL8呈正相關。

CCL8（MCP-2）屬于一組小的分泌型炎癥性細胞因子，對特定的白細胞具有趨化作用，這些細胞因子被命名為chemokine。根據(jù)其4個半胱氨酸在序列中的位置可分四組：α組為C-X-C；β組為C-C；γ組缺乏和第三個半胱氨酸；此三組分子量在7-15KD之間。第四組為C-X3-C，序列長度達到373個氨基酸。MCP-2屬于第二組的chemokine。小鼠的MCP-2的前體有109個氨基酸，成熟形態(tài)為76個氨基酸。

檢測指標：CCL8；MCP-2；MCP2；單核細胞趨化蛋白2
檢測范圍：15.6pg/ml～1000pg/ml
特異性：系統(tǒng)和其它細胞因子無交叉反應
敏感性：＜0.5pg/ml

產(chǎn)品組成：

儲存條件：2-8℃（頻繁使用時），-20℃（長時間不用時）
有效期： 6個月(4℃)；12個月（-20℃）

參考標準曲線數(shù)據(jù)：(取自某一批次質(zhì)檢數(shù)據(jù)，僅供參考，用戶需要自己建立標準曲線)

小鼠趨化因子CCL8檢測試劑盒(ELISA方法)原理:

問：請問標曲是每次都要做嗎？

答：是的，每次實驗，孵育時間，洗板次數(shù)等等條件均不一樣，不同實驗的標曲不能混用，做一次實驗需要做一次標準曲線，并且用當次，同一塊板上的標準曲線結果去計算板內(nèi)樣品的濃度，才能得到準確的結果。

問：做預實驗時每種要做幾個復孔呀？

答：預實驗視情況而定，如果整個板子孔數(shù)較為充足，建議兩個復孔，如不充足，單孔也可以。要盡量保證實驗過程中加樣準確。

問：血清樣本少量溶血，顏色稍深，對結有影響嗎？

答：會有影響，建議取樣時需注意，避免溶血、脂血等樣本。如樣本條件受限，建議用樣本稀釋液適當稀釋，減少基質(zhì)效應影響。

問：試劑盒有推薦稀釋濃度還需要自己測嗎？

答：試劑盒一般會給出不同樣品的推薦稀釋比例，但是為大致范圍，還是根據(jù)自己的樣本情況，設計預實驗測量計算。

問：加完終止液之后測的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大？

答：加完終止液后，顯色反應也不是永遠停止，形成的黃色顏色會隨著時間延長繼續(xù)加深，建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。

問：副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎？

答：復孔值差異較大，主要原因應考慮加樣是否準確，洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。

問：配好的抗體沒用完如何保存，可保存多久？預實驗用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實驗嗎？

答：一般來講，配好的母液，可以在四度保存，多一個月左右。剩下的板子和試劑是可以繼續(xù)用于正式實驗的，間隔時間不要太長，一個月之內(nèi)均可，需注意試劑避免污染，板子保持干燥。

問：后顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎？

答：有的，建議標準曲線高濃度點的OD值在2.0左右較好，也可參考說明書標曲的數(shù)據(jù)。

問：樣本總是在標準曲線之外，稀釋100倍也是，怎么辦？

答：在設置稀釋倍數(shù)之前，需要參考相關文獻，對于一些表達*的蛋白，確實會出現(xiàn)這種情況，建議繼續(xù)提高稀釋比例。

問：試劑盒推薦用450和540nm雙波長檢測，但條件有限可否換成450和620的雙波長？如何使用校準波長？還有，用空白孔校準可以么？

答：可以的，TMB底物顯色后，吸光峰值在450nm，另外的校準波長是防止氣泡等雜質(zhì)造成的干擾設置，避開450左右50nm以上即可。兩次讀取的OD值，用OD450 - OD校準波長即可。盡量還是建議有條件的選用雙波長校準的方法，因為避免了不同孔的讀數(shù)影響，防止出現(xiàn)空白孔污染，導致讀數(shù)較高，無法校準的情況。

問：ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么？

答：可以的，選用支持組織勻漿的ELISA試劑盒即可，將組織樣品或細胞樣品進行裂解，提取胞內(nèi)蛋白后進行蛋白定量，保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

問：ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

答：HRP酶標二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為TMB，TMB不穩(wěn)定，曝光或污染氧化后會出現(xiàn)顯色反應，導致實驗背景升高，或無法使用，所以愛必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份，方便穩(wěn)定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩(wěn)定影響實驗結果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測是否為無色透明，如果是正常的，對結果也沒有影響，可以放心使用。

問：整個過程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？

答：ELISA實驗中，在酶標抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹，或?qū)⒄麄€ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。