小鼠單克隆抗體Ig類/亞類鑒定ELISA試劑盒

本試劑盒用于培養(yǎng)上清中小鼠單克隆抗體Ig類、亞類的鑒定以及相關(guān)內(nèi)容的研究。利用雙抗體夾心法鑒定小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤培養(yǎng)上清中單克隆抗體或特異親和純化的單克隆抗體的類和亞類（可區(qū)分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA）。采用小鼠抗體共有位點(diǎn)的二抗包被微孔板，與加入的培養(yǎng)上清中的小鼠抗體結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的抗小鼠各類、亞類的抗體來分別反應(yīng)，后用TMB底物系統(tǒng)顯色并用稀硫酸終止，再通過酶標(biāo)儀檢測吸光度來判斷被測單克隆抗體的類或亞類。本試劑盒具有*的分辨率，是您鑒定小鼠單克隆抗體類、亞類的可靠工具。 試劑盒組成：

保存：2～8℃避光，有效期一年。 使用方法： 1．首先將試劑盒恢復(fù)室溫（大約30分），然后用純水把清洗液配成工作濃度（一份濃縮清洗液加19份純水）。 2．取出酶標(biāo)板。每個標(biāo)本需要6孔，陽性對照6孔，陰性對照6孔。多余的用自封袋保存，記得放入干燥劑。 3．將標(biāo)本檢測孔每孔先加入標(biāo)本稀釋液各50μl。然后將50μl細(xì)胞培養(yǎng)上清（或特異親和純化的抗體）再加入酶標(biāo)微孔板，每個標(biāo)本加6孔；陽性對照和陰性對照孔不加標(biāo)本稀釋液也是各加6孔每孔100μl。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。 4．棄去板內(nèi)液體，洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干或機(jī)洗5遍。再在每個標(biāo)本的6孔中分別加入6種酶標(biāo)二抗各100μl，通用陽性、陰性對照的各孔也一樣。在加樣圖上或酶標(biāo)板上做好標(biāo)記。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。 5．吸棄板內(nèi)液體，洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干或機(jī)洗5遍。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板避光37℃顯色20分鐘。 6．本試劑盒特異性好一般肉眼即可觀察出結(jié)果，看顯色藍(lán)的那個孔所對應(yīng)的酶標(biāo)二抗就知道此標(biāo)本的Ig類或亞類。更可將反應(yīng)終止液（每孔50μl）終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀450nm測定波長，630nm參考波長雙波長測定結(jié)果，參看高值孔所對應(yīng)的酶標(biāo)二抗就知道此標(biāo)本的Ig類或亞類(陽性對照OD一般不小于0.8，陰性對照一般不高于0.15，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品OD大于陰性O(shè)D+0.15，陰性O(shè)D低于0.05按0.05算)。 注意事項(xiàng)： 1．雖然本試劑盒過期后很久還有使用價(jià)值但還是請您在有效期內(nèi)使用。 2．在檢測腹水類單抗時(shí)要稀釋到1/5萬，雖然可以分辨但并不建議您這樣做。此類樣品成分十分復(fù)雜，有干擾結(jié)果的可能。在此種情況下您可以選擇本公司的F030215抗體鑒定試劑。它會給您帶來滿意的結(jié)果,同時(shí)您也可以使用抗原包被板來解決此類問題。 3．手洗板子時(shí)一定要把孔加滿，停留10秒然后棄盡，后要拍干凈。特別是在酶標(biāo)二抗溫育后洗板時(shí)一定要把酶吸出而不是甩出，要吸凈。這個在手工洗板時(shí)對結(jié)果很重要。 4．一次沒用完的板子要帶干燥劑放自封袋封好，隨盒存放。 5．拿放板子時(shí)不要劇烈抖動，以免孔間交叉污染出現(xiàn)錯誤結(jié)果。 6．通用陽性對照數(shù)據(jù)并不一定*一樣，僅作為試劑有效指示。 本試劑盒一般不會出現(xiàn)兩個陽性，但出現(xiàn)兩個陽性的現(xiàn)象不論在進(jìn)口或國產(chǎn)試劑中都是真實(shí)存在的，一般會一個OD很高,另一個很低但卻還能判為陽性，實(shí)驗(yàn)分析表明這種情況下以O(shè)D高值孔為準(zhǔn)，出現(xiàn)這種情況有多重原因： 1．培養(yǎng)的細(xì)胞中有“飼養(yǎng)細(xì)胞”殘留； 2．抗體本身存在變異； 3．樣品為非特異親和純化的抗體或樣品是腹水； 4．上清出現(xiàn)少量污染； 5．實(shí)驗(yàn)操作粗放； 6．加錯試劑。

小鼠單克隆抗體Ig類/亞類鑒定ELISA試劑盒原理:

問：請問標(biāo)曲是每次都要做嗎？

答：是的，每次實(shí)驗(yàn)，孵育時(shí)間，洗板次數(shù)等等條件均不一樣，不同實(shí)驗(yàn)的標(biāo)曲不能混用，做一次實(shí)驗(yàn)需要做一次標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且用當(dāng)次，同一塊板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果去計(jì)算板內(nèi)樣品的濃度，才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

問：做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)每種要做幾個復(fù)孔呀？

答：預(yù)實(shí)驗(yàn)視情況而定，如果整個板子孔數(shù)較為充足，建議兩個復(fù)孔，如不充足，單孔也可以。要盡量保證實(shí)驗(yàn)過程中加樣準(zhǔn)確。

問：血清樣本少量溶血，顏色稍深，對結(jié)有影響嗎？

答：會有影響，建議取樣時(shí)需注意，避免溶血、脂血等樣本。如樣本條件受限，建議用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋，減少基質(zhì)效應(yīng)影響。

問：試劑盒有推薦稀釋濃度還需要自己測嗎？

答：試劑盒一般會給出不同樣品的推薦稀釋比例，但是為大致范圍，還是根據(jù)自己的樣本情況，設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)測量計(jì)算。

問：加完終止液之后測的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大？

答：加完終止液后，顯色反應(yīng)也不是永遠(yuǎn)停止，形成的黃色顏色會隨著時(shí)間延長繼續(xù)加深，建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。

問：副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎？

答：復(fù)孔值差異較大，主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確，洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。

問：配好的抗體沒用完如何保存，可保存多久？預(yù)實(shí)驗(yàn)用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)嗎？

答：一般來講，配好的母液，可以在四度保存，多一個月左右。剩下的板子和試劑是可以繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)的，間隔時(shí)間不要太長，一個月之內(nèi)均可，需注意試劑避免污染，板子保持干燥。

問：后顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎？

答：有的，建議標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度點(diǎn)的OD值在2.0左右較好，也可參考說明書標(biāo)曲的數(shù)據(jù)。

問：樣本總是在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，稀釋100倍也是，怎么辦？

答：在設(shè)置稀釋倍數(shù)之前，需要參考相關(guān)文獻(xiàn)，對于一些表達(dá)*的蛋白，確實(shí)會出現(xiàn)這種情況，建議繼續(xù)提高稀釋比例。

問：試劑盒推薦用450和540nm雙波長檢測，但條件有限可否換成450和620的雙波長？如何使用校準(zhǔn)波長？還有，用空白孔校準(zhǔn)可以么？

答：可以的，TMB底物顯色后，吸光峰值在450nm，另外的校準(zhǔn)波長是防止氣泡等雜質(zhì)造成的干擾設(shè)置，避開450左右50nm以上即可。兩次讀取的OD值，用OD450 - OD校準(zhǔn)波長即可。盡量還是建議有條件的選用雙波長校準(zhǔn)的方法，因?yàn)楸苊饬瞬煌椎淖x數(shù)影響，防止出現(xiàn)空白孔污染，導(dǎo)致讀數(shù)較高，無法校準(zhǔn)的情況。

問：ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么？

答：可以的，選用支持組織勻漿的ELISA試劑盒即可，將組織樣品或細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解，提取胞內(nèi)蛋白后進(jìn)行蛋白定量，保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

問：ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

答：HRP酶標(biāo)二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為TMB，TMB不穩(wěn)定，曝光或污染氧化后會出現(xiàn)顯色反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)背景升高，或無法使用，所以愛必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份，方便穩(wěn)定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩(wěn)定影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測是否為無色透明，如果是正常的，對結(jié)果也沒有影響，可以放心使用。

問：整個過程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？

答：ELISA實(shí)驗(yàn)中，在酶標(biāo)抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹，或?qū)⒄麄€ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。