K599 Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 （CAT#: AE1080）
K599 Electro：                                                             50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )：                 10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                          -80℃（12個月）

基因型

Agrobacterium rhizogenes (str^R ) pRi2659 (agropine type)

K599 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說明

發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物。K599發(fā)根農(nóng)桿菌（NCPPB2659）含有pRi2659農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒，具有廣泛的宿主范圍（葫蘆科，豆科，茄科等），同時具有鏈霉素抗性。開發(fā)的K599電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒（卡那霉素抗性）檢測，轉(zhuǎn)化效率>10⁵ cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒（size:40 kd）檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×10³ cfu/μg DNA。

常規(guī)操作方法

 1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，用試劑盒抽提，雙蒸水溶解；轉(zhuǎn)化效率較高，第次使用前做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯從冰中拿出，吸水紙吸干外表面水份，快速放入電轉(zhuǎn)槽中，啟動電擊，電擊完成快速插入冰中，加入1 ml無抗生素的TY，并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

● 農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

常用農(nóng)桿菌抗性： (R：抗；S：敏感。)

● TY配方（1L）：

   Tryptone                5g

   Yeast extract          3g

   補水到1L體積，*溶解后，121度、20分鐘高溫滅菌

   配制1M的氯化鈣水溶液，121度、20分鐘高溫滅菌

   每1L 滅菌的TY液體營養(yǎng)液中加入10ml 無菌的1M氯化鈣水溶液即可。

   若配制TY固體培養(yǎng)基，則加入15g 瓊脂粉。

注意事項

1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中不可混入氣泡，轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或終用于涂板的菌量。

4. K599具有鏈霉素抗性，不可用于具有鏈霉素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。