GV3101 Electroporation-Competent Cell

產品規(guī)格 

GV3101 Elec：                                                             50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )                    10μl
保存條件(保質期)：                                         -80℃（12個月） 

基因型

C58 (rif^R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^R) Nopaline

GV3101 Electroporation-Competent Cell產品說明

GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。開發(fā)的GV3101電轉感受態(tài)特別適用于大質粒的轉化：經pCAMBIA2301質粒 (size:11633 bp)檢測轉化效率>10⁵ cfu/μg DNA；經pCAMBIA2301-ZH質粒 (size:40 kd)檢測轉化效率可達5×10³ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉化效率較高，次使用前做預實驗確定所加質粒的量），用手管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。