非洲馬瘟病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

African Horse Sickness Virus(AHSV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

非洲馬瘟病毒(African Horse Sickness Virus，AHSV)會(huì)引起非洲馬瘟，是 一種馬屬動(dòng)物的急性或亞急性傳染病，該病以發(fā)熱、皮下結(jié)締組織與肺水腫以及 內(nèi)臟出血為特征，只能通過昆蟲傳播。馬對此病的易感性高，病死率高達(dá) 95%。 本病發(fā)生有明顯的季節(jié)性和地域性，多見于溫?zé)岢睗窦竟?jié)，常呈地方流行或暴發(fā) 流行，傳播迅速，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本公司產(chǎn)品開發(fā)非 洲馬瘟病毒染料法熒光定量 RT-PCR 試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據(jù)非洲馬瘟病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá) 到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中 間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

非洲馬瘟病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。陽性對照需要因易污染其他成分需 要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 段作為陽性對照。

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò) 散傳染性病原。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重 復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 二、樣品 RNA 的制備

5. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照 梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

6. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 20 次免 RNA 提取的天凈沙核酸釋放劑試 用裝，

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用 于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如 果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用 于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(gè)用 于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析 的步驟，定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。

8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

4. 上機(jī)進(jìn)行 RT-PCR，RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為:2μL

 按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理

10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于 或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等 于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大 于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。