禽類支原體通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Avian Mycoplasma spp.

產(chǎn)品及特點(diǎn)

禽類支原體通用(Avian Mycoplasma spp.) 會(huì)引發(fā)禽支原體病，主要包括雞敗血 支原體病、雞傳染性滑液膜炎和火雞支原體病三種，禽支原體病幾乎在世界各地都有發(fā) 生，已成為雞群和火雞群的一個(gè)重要問題。禽支原體病主要發(fā)生在 1-2 月齡的幼雛，癥 狀也較成雞嚴(yán)重，病初見鼻液增多，流出漿性和粘性鼻液，初為透明水樣，后變黃較濃 稠，常見一側(cè)或兩側(cè)鼻孔堵塞，病雞呼吸困難，頻頻搖頭，打噴嚏；雞冠、肉髯發(fā)紫， 呼吸羅音，夜間更明顯；初期精神和食欲尚可，后期食欲減少或不食，幼雞生長受阻； 患雞頭部蒼白，跗關(guān)節(jié)或爪墊腫脹；急性病雞糞便常呈綠色，有的病雞流淚，眼瞼腫脹， 因眶下竇積有干酪樣滲出物導(dǎo)致上下眼瞼粘合，眼球突出呈“凸眼金魚”樣，重者可導(dǎo) 致一側(cè)或兩側(cè)眼球萎縮或失明，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p害，因此禽類支原體通用的快速準(zhǔn) 確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的禽類支原體通 用染料法熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)禽類支原體通用保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 

禽類支原體通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬 不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽性對(duì) 照

2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。 二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照）， 一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對(duì)照的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號(hào)（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求 的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品， 則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。 

10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè) 樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù)，則 反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。

13. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)， 大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光 譜在 530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則 為陰性，如果小于 40，則為陽性。