斑點叉尾鮰病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Channel Catfish Virus(CCV)

產品及特點

斑點叉尾鮰病毒(Channel Catfish Virus，CCV)會引起斑點叉尾鮰病毒病，主要 感染斑點叉尾鮰的魚苗和魚種，成魚也可發(fā)生隱性感染稱為帶毒者。病魚臨床表現為食 欲下降，離群獨游，反應遲鈍；嗜睡、打旋或水中垂直懸掛，后沉入水中死亡；病魚 鰭基部、腹部和尾柄處出血，腹部膨大，雙眼突出，表皮發(fā)黑，鰓蒼白，肛門紅腫外突； 解剖可見胃擴張，肌肉出血，消化道內無食物，腸道內有淡黃色黏液，腹腔內有黃色或 淡紅色液體；腎、肝、脾貧血或出血，脾臟通常腫大變黑，后腎嚴重損傷。隱性帶毒者 一般無臨床癥狀。對養(yǎng)魚業(yè)造成巨大影響，因此斑點叉尾鮰病毒的快速準確鑒定對該病 的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的斑點叉尾鮰病毒染料法熒光 定量 PCR 檢測試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據斑點叉尾鮰病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

斑點叉尾鮰病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬 不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽性對 照

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求 的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品， 則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。 

10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個 樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復，則 反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢 后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行 優(yōu)化）。

13. 數據采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時， 大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光 譜在 530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。

四、數據處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱 軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則 為陰性，如果小于 40，則為陽性。