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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號(hào)	XY-0221	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴(kuò)增效率、更高的擴(kuò)增靈敏度、更高的擴(kuò)增特異性。

牛棒桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Corynebacterium bovis

產(chǎn)品及特點(diǎn)

牛棒狀桿菌病(Bovine Corynebacteriosis)是指由棒狀桿菌屬(Coryne bacterium spp.)的某些細(xì)菌引起的膀胱炎和腎盂腎炎。臨床主要特征為頻尿、濁尿、血尿和發(fā)熱。該病主要見于成年母牛，多在妊娠期和產(chǎn)后發(fā)病。本病分布于世界各地。本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)牛棒桿菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據(jù)牛棒桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他微生物。

3. 引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測(cè)，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

牛棒桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號(hào)	成分	規(guī)格
試劑一	2×PCR MagicMix	500μL（棕色）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	牛棒桿菌染料法 qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	牛棒桿菌染料法 qPCR 陽性對(duì) 照(1×10E8 拷貝/μL)	50μL（紅蓋）
試劑五	天凈沙核酸釋放劑試用裝	20 次（1mL，綠蓋））
試劑六	使用手冊(cè)	1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽性對(duì)照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào)，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

成分	樣品管 N+2 個(gè)	PCR 陰性對(duì)照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
牛棒桿菌染料法 qPCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自備 10×ROX (見注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 個(gè)待測(cè)樣品 DNA 模板	6 μL
自備超純水		6 μL
第 7 步所得 PCR 陽性對(duì)照稀釋液（2-7 號(hào)）			各 6μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…）

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

過程	溫度	時(shí)間
預(yù)熱	50℃	2 min
預(yù)變性	95℃	10 min
PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)）	95℃	15 sec
PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)）	60℃	1 min（采集 SYBR 通道的熒光信號(hào)）

五、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 32。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性，如果小于或等于 30 則為陽性。如果在 30-32 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性，如果小于 30，則為陽性。