牛腎盂腎炎棒桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Corynebacterium renale

產(chǎn)品及特點(diǎn)

腎棒狀桿菌(Corynebacterium Renale)革蘭氏染色陽性，為球桿狀或棍棒 狀，呈單在、成叢或柵欄樣排列。細(xì)菌性腎盂腎炎由腎棒狀桿菌引起，主要發(fā)生 于母牛，公牛少見，馬和綿羊偶可發(fā)生。本病為尿源性感染，因此病原菌經(jīng)尿道 生殖道口感染后，先引起尿道炎、膀胱炎，然后再逆行導(dǎo)致腎盂腎 炎。由于腎組織損傷與尿液滯留，終病畜可因尿毒癥而死亡。病牛主要表現(xiàn)發(fā) 熱，食欲不振，尿頻，尿少，尿因混有黏液、膿液、大量蛋白質(zhì)、膿細(xì)胞和白細(xì) 胞、脫落的上皮細(xì)胞等而渾濁帶血色。尿液涂片或細(xì)菌培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)病原菌。嚴(yán)重 病例常發(fā)生尿毒癥。本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門 檢測(cè)牛腎盂腎炎棒桿菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據(jù)牛腎盂腎炎棒桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他微生物。

3. 引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測(cè)，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

牛腎盂腎炎棒桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽性對(duì)照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備 陽性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定 性分析，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào)，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 32。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性，如果小 于或等于 30 則為陽性。如果在 30-32 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性，如果小于 30，則為陽性。