隱孢子蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Cryptosporidium spp

產(chǎn)品及特點

隱孢子蟲(Cryptosporidium)為體積微小的球蟲類寄生蟲，廣泛存在多種脊椎動 物體內(nèi)，寄生于人和大多數(shù)哺乳動物的主要為微小隱孢子蟲(C. parvum)，引起隱孢子 蟲病(cryptosporidiosis)，是一種以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的人畜共患性原蟲病，因此對 隱孢子蟲進(jìn)行快速靈敏的診斷具有重要的意義。本產(chǎn)品就是根據(jù)隱孢子蟲 rRNA 編碼基 因的保守區(qū)設(shè)計引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產(chǎn)品。本試劑盒具有下列特點： 

1. 根據(jù)隱孢子蟲 OWP（oocyst wall protein）編碼基因保守序列設(shè)計的專一性引物， 與其他腸道疾病病原體 

2. 靈敏度比常規(guī) PCR 高 2-3 個數(shù)量級，可以達(dá)到幾十拷貝/反應(yīng)。

3. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準(zhǔn)確快速。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 100 次 20uL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

隱孢子蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存(A 袋試劑放樣品準(zhǔn)備區(qū)、C 袋的陽性對照分開放置)，有效期 一年。 

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)原蟲 DNA 提取試劑盒兼 容。本公司的柱式糞便 DNA 提取試劑盒也可以用于隱孢子蟲 DNA 提取。 二、引物的制備（在樣品制備室進(jìn)行）

2. 按引物標(biāo)簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見引物試管上 的標(biāo)簽），使得兩條引物的濃度均為 10μM（10pmol/μL），然后各取 110μL 混 合在一起得 220μL，標(biāo)注為引物混合物，放冰上待用。220μL 足夠 100 次 qPCR 反應(yīng)。

三、稀釋陽性對照

（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成 分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照， 只提供可以直接使用的長為 150bp 的 DNA 段作為陽性對照。

3. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

4. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 換槍頭，從 6 號管中取 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

8. 換槍頭，從 5 號管中取 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得 1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

9. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行） 10. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管 和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子 儲存好后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。

12. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。一般在復(fù)性步驟采集熒光數(shù)據(jù)。本產(chǎn)品中所 含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時，大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時的大 吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光譜在 530 nm。

四、數(shù)據(jù)處理

13. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品 的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。