溶組織內(nèi)阿米巴染料法熒光定量PCR試劑盒

Entamoeba histolytica

產(chǎn)品及特點(diǎn)

阿米巴原蟲(chóng)由于生活環(huán)境不同可分為內(nèi)阿米巴和自由阿米巴，前者寄生于人和動(dòng) 物，后者生活在水和泥土中，偶爾侵入動(dòng)物機(jī)體。對(duì)人類危害大的是屬于內(nèi)阿米巴屬 的溶組織內(nèi)阿米巴（Entamoeba histolytica），它會(huì)引發(fā)阿米巴痢疾和肝膿腫，引發(fā) 的病例多，感染面廣，危害大。因此對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴進(jìn)行快速靈敏的診斷具有重要的 意義。本產(chǎn)品就是根據(jù)溶組織內(nèi)阿米巴 rRNA 編碼基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物而開(kāi)發(fā)的高靈 敏熒光定量 PCR 產(chǎn)品。本試劑盒具有下列特點(diǎn)：  

1. 根據(jù)溶組織內(nèi)阿米巴 rRNA 編碼基因保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與其他腸道疾病 病原體 無(wú)交叉反應(yīng)。 

2. 靈敏度比常規(guī) PCR 高 2-3 個(gè)數(shù)量級(jí)，可以達(dá)到幾十拷貝/反應(yīng)。

3. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 100 次 20uL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

溶組織內(nèi)阿米巴染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存(A 袋試劑放樣品準(zhǔn)備區(qū)、C 袋的陽(yáng)性對(duì)照分開(kāi)放置)，有效期 一年。 

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見(jiàn)使用方法）。

使用方法 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)原蟲(chóng) DNA 提取試劑盒兼 容。本公司的柱式糞便 DNA 提取試劑盒也可以用于隱孢子蟲(chóng) DNA 提取。 二、引物的制備（在樣品制備室進(jìn)行）

2. 按引物標(biāo)簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見(jiàn)引物試管上 的標(biāo)簽），使得兩條引物的濃度均為 10μM（10pmol/μL），然后各取 110μL 混 合在一起得 220μL，標(biāo)注為引物混合物，放冰上待用。220μL 足夠 100 次 qPCR 反應(yīng)。

三、稀釋陽(yáng)性對(duì)照

（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成 分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照， 只提供可以直接使用的長(zhǎng)為 150bp 的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。

3. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

4. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

7. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

8. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 4 號(hào)管中，得 1×10E4 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

9. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管 和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子 儲(chǔ)存好后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。

12. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。一般在復(fù)性步驟采集熒光數(shù)據(jù)。本產(chǎn)品中所 含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)，大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大 吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光譜在 530 nm。

四、數(shù)據(jù)處理

13. 以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品 的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。