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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0269	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴(kuò)增效率、更高的擴(kuò)增靈敏度、更高的擴(kuò)增特異性。

陰溝腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

Enterobacter cloacae

產(chǎn)品及特點(diǎn)

陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)是腸桿菌目腸桿菌科腸桿菌屬的一種細(xì) 菌，廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便水、泥土、植物中均可檢出，是腸道正常菌種之一。其引起的細(xì)菌感染性疾病，常累及多個器官系統(tǒng)，包括皮膚軟組織感染、泌尿道感染呼吸道感染以及敗血癥等由于陰溝腸桿菌能產(chǎn)生超廣譜β- 內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)和 Amp C 酶耐藥情況嚴(yán)重，給臨床治療帶來了新的挑戰(zhàn)。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測陰溝腸桿菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)陰溝腸桿菌高度保守區(qū)設(shè)計，，不會跟其他病毒株 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

陰溝腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色蓋）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	陰溝腸桿菌探針法 qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	陰溝腸桿菌 qPCR 探針	50 μL（棕色管）
試劑五	陰溝腸桿菌探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL)	50 μL（黃蓋）
試劑六	使用手冊	1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。 10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2個	PCR陰性對照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
陰溝腸桿菌qPCR探針	1 μL	1 μL	各1 μL
陰溝腸桿菌探針法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2個待測DNA模板	7 μL	不加	不加
超純水	不加	7 μL	不加
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號）	不加	不加	各7 μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

過程	溫度	時間
預(yù)變性	95℃	5 min
PCR反應(yīng) （40個循環(huán)）	95℃	15sec
PCR反應(yīng) （40個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。