馬動脈炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Equine Arteritis Virus(EAV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

馬動脈炎病毒(Equine Arteritis Virus，EAV)是一種 RNA 病毒，病馬出現(xiàn) 以淋巴細(xì)胞減少為特征的白細(xì)胞減少癥，臨診病期大約 14 天，表現(xiàn)厭食、精神沉 郁、四肢嚴(yán)重水腫，步伐僵直，眼、鼻分泌物增加，面部、頸部、臀部形成皮膚 疹塊，因此馬動脈炎病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本 產(chǎn)品基于 PCR 原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn)：

1.一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2.根據(jù)馬動脈炎病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

馬動脈炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供DNA段作為陽性對照。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
2.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
3.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
5.如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6.用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè)，其余不變。
8.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）： 

9.上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理

10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于 或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等 于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大 于或等于