埃希氏菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Escherichia spp.

產(chǎn)品及特點(diǎn)

大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌（Escherichia coli），屬于革蘭氏陰性細(xì)菌。 大腸桿菌 O157:H7 是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的常見類型，O 表示抗原類型, H7 表示血清型。其感染劑量極低， 人體只要攝入 10 個細(xì)菌就可以致病，目前還沒有*疫苗，因此大量開展預(yù)防 檢測工作具有重要的意義。目前對 O157 的檢測主要是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學(xué) 和分子水平的 PCR 檢測。本試劑盒就是利用實時熒光定量 PCR 技術(shù)開發(fā)的大 腸桿菌 O157:H7 檢測試劑盒，它通過熒光染料實時顯示樣品模板 DNA 的量， 并通過坐標(biāo)曲線表示出來，結(jié)果直觀準(zhǔn)確。它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準(zhǔn)確快速。

2. 熒光定量 PCR 檢測，反應(yīng)特異性強(qiáng)。

3. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 

埃希氏菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品等

使用方法 一、樣品 DNA 的制備 用自選方法提取細(xì)菌樣品 DNA。注意：DNA 純化方法是決定檢測靈敏度的 關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA，后面的 PCR 再靈敏也不能提高整體檢 測靈敏度。

二、制備 O157:H7 標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo) 準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣 品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品 不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的 DNA 段 作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到 10E7 拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7 拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。

4. 在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 O157:H7 陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對照。

5. 換槍頭，從 6 號管中取 5 μL 溶液到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 拷貝/μL 的陽性對照。

6. 換槍頭，從 5 號管中取 5 μL 溶液到 4 號管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。

7. NC 管中不加任何陽性對照。

8. 從 1-6 號管中分別取 5 μL 和待測樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見下步），每個 樣品做 3 次重復(fù)。PCR 后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值， 并以之為縱軸，以濃度的對數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三、PCR 檢測（20 μL 體系）

1. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次）

2. 建議 PCR 反應(yīng)參數(shù)（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化） 

3. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時，大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm， 大發(fā)射光譜在 530 nm。

四、數(shù)據(jù)處理

以 O157:H7 陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。再以待測樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過待測樣品的 Ct 值 計算出樣品 DNA 的濃度。