人鼻病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Human Rhinovirus

產(chǎn)品及特點(diǎn)

人鼻病毒(Human Rhinovirus)是小RNA病毒科、鼻病毒屬的一種，是人患普通感冒的主要病原。鼻病毒抗原性復(fù)雜，有100多個(gè)血清型，感染后可獲得免疫力，但維持時(shí)間短，尚無(wú)特異預(yù)防和治療方法。該病毒感染后常表現(xiàn)為感冒癥狀，大約有10%~20%的成年人感冒是由HRV感染引起，而嬰幼兒感冒有15%~30%是由HRV致病。該病毒的感染具有自限性，但是有時(shí)會(huì)引起諸如哮喘、充血性心衰、支氣管擴(kuò)張，包囊纖維化等嚴(yán)重并發(fā)癥，并且該病毒多與其它呼吸道病毒合并感染，例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠狀病毒以及腸道病毒等，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害，因此人鼻病毒通用的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的人鼻病毒通用染料法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2.根據(jù)人鼻病毒通用保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
3.靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4.一管式熒光定量PCR檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

人鼻病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑   DNA模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。 

使用方法 一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1.注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的DN片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

2.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8.如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10.如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

12.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時(shí)的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。