改良安卡拉痘苗病毒染料法定量PCR試劑盒

Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA)

產(chǎn)品及特點

改良安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Virus Ankara，MVA)是一種減毒病毒，它衍生自修飾的安卡拉痘苗病毒，它的特征是失去了在人類細胞系中重復(fù)復(fù)制的能力。本發(fā)明進一步描述了衍生于該病毒的重組病毒及該病毒或其重組體作為藥物或疫苗的用途。此外，本發(fā)明提供了一種甚至在免疫受損患者，對疫苗病毒已有免疫力的患者或正在接受抗病毒治療的患者中都能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，因此改良安卡拉痘苗病毒的快速準確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的改良安卡拉痘苗病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2.根據(jù)改良安卡拉痘苗病毒保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3.靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
4.一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

改良安卡拉痘苗病毒染料法定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1.注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA段作為陽性對照。
2.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8.如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10.如果只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

12.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。