牛分枝桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Mycobacterium bovis

產(chǎn)品及特點

牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)是引起牛結(jié)核病的主要病原體，舊稱牛 型結(jié)核分枝桿菌，對牛和其他家畜有致病性。形態(tài)、染色和生長特性與人型結(jié)核 分枝桿菌基本相似。在抗原結(jié)構(gòu)上，牛型菌株與人型菌株有共同抗原存在，因而 可用減毒的牛分枝桿菌(即卡介苗)接種預(yù)防人的結(jié)核病。本菌能引起牛、馬、豬 的進行性和致死性結(jié)核病。對綿羊和山羊也可引起進行性結(jié)核病，但不常見。人 對本菌也易感，特別是兒童，絕大多數(shù)病例受害部位為淋巴結(jié)和腹腔器官， 肺 部受侵害的不常見。因此牛分枝桿菌的檢測具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以染料 法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測牛分枝桿菌的試劑盒，它具有下列 特點：

1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據(jù)牛分枝桿菌高度保守區(qū)設(shè)計,不會擴增其他細菌。

3. 引物和擴增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

牛分枝桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，好用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果進行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定 性分析，則 6 個標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。