支原體通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Mycoplasma spp

產品及特點

支原體和親緣關系很近的無膽甾原體還有螺旋體統(tǒng)稱霉形體。霉形體是目前發(fā)現(xiàn)的 小的的原核生物。它們缺乏細胞壁、有變形能力、能通過濾菌器、可在無 生命培養(yǎng)基中生長繁殖，成為細胞培養(yǎng)中常見的一種污染源，嚴重影響細胞生長率、 細胞形態(tài)、基因表達、細胞代謝和細胞活力。因此，對以支原體為主的霉形體進行早 期檢測非常重要，它能使得研究人員在污染擴散前快速采取有效措施，減低損失。本 公司開發(fā)支原體通用染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點： 

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 引物根據支原體專一區(qū)設計，特異性高。

3. 熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。  

支原體通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千 萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病 原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽 性對照。

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。制備所得成為樣品 DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容。

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性 分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟， 定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢 后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據儀器不同而自行 優(yōu)化）。

四、數(shù)據處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱 軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct 值小于 40，擴增曲線有 明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。