豬圓環(huán)病毒通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Porcine Circovirus(PCV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus，PCV)有 PCV-1 和 PCV-2 兩種型，其基因組為 單鏈 DNA，長(zhǎng)度分別為 1759nt 和 1768nt，其同源性低于 80%，但基因組結(jié)構(gòu)相似。 PCV-1 無(wú)致病性，廣泛存在于豬體內(nèi)。PCV-2 對(duì)豬具有較強(qiáng)的易感性，感染豬可自鼻 液、糞便等廢物中排出病毒，經(jīng)口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬。感染病毒后的病 豬常見的癥狀是豬只漸進(jìn)性消瘦或生長(zhǎng)遲緩，這也是診斷所必需的臨床依據(jù)，其他癥 狀有厭食、精神沉郁、行動(dòng)遲緩、皮膚蒼白、被毛蓬亂、呼吸困難，咳嗽為特征的呼吸 障礙，較少發(fā)現(xiàn)的癥狀為腹瀉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，一旦感染該病毒，發(fā)病率一般很低 而病死率都很高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失，因此豬圓環(huán)病毒通用的快速準(zhǔn)確鑒定 對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的豬圓環(huán)病毒通用染料 法熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)： 

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)PCV-1和PCV-2共同的保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 可以同時(shí)測(cè)出 PCV-1 和 PCV-2，但不能分型。

5. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。

6. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

7. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 

豬圓環(huán)病毒通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 

一、稀釋 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽(yáng)性對(duì)照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千 萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病 原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽(yáng) 性對(duì)照。

2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）， 一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL PCR 陽(yáng)性對(duì)照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。制備所得成為樣品 DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上 步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性 分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用 第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟， 定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。

13. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)， 大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光 譜在 530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等 于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為 陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則 為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。