狂犬病病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Rabies Virus

產(chǎn)品及特點

狂犬病病毒（Rabies Virus, RV）屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬，為 RNA 病毒，它 是引起狂犬病的病原體?？袢《緯l(fā)狂犬病，屬于人畜共患的傳染病，由于該病毒 能對人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害，因此快速檢測狂犬病病毒具有重要意義。本試劑盒根據(jù) RT-PCR 原理開發(fā)，具有下列特點：

1. 使用本公司開發(fā)的一管式熒光定量 RT-PCR試劑盒，靈敏度比常規(guī) RT-PCR高2-3 個數(shù)量級，可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

2. 封閉式，避免擴(kuò)張產(chǎn)物對后續(xù)實驗的污染。

3. 根據(jù)狂犬病病毒的保守序列設(shè)計的專一性 RT-PCR 引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

4. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準(zhǔn)確快速。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 RT-PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 

狂犬病病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存(陽性對照分開放置)，有效期一年。 

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、 稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

1. 注意：本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的核酸片段作為陽 性對照。下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的 其他成分。

2. 標(biāo)記 6 個 RNase-free 離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯 RNase-free 槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，從 6 號管中取 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備 8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液 中的第 4 號（濃度為 1×10E4 copy/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃 度為 1×10E5 copy/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備 的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要 求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試 劑盒兼容。

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個 樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照，6 個用于 RT-PCR 陽性對照）。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）： 

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（具體 RT-PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不 同而自行優(yōu)化）。 

13. 如果 PCR 陽性對照和 PCR 陰性對照均得到預(yù)期陽性和陰性結(jié)果，則說明 PCR 有 效，可以進(jìn)行后續(xù)分析。以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值， 再推算出其濃度。

14. 如果 PCR 陽性對照或 PCR 陰性對照任何一個沒有得到預(yù)期陽性和陰性結(jié)果（如 PCR 陽性對照沒有擴(kuò)增，或陰性對照出現(xiàn)擴(kuò)增），則說明 PCR 實驗無效或污染， 不需要進(jìn)行后續(xù)分析，需要重復(fù) PCR 或請跟廠家聯(lián)系。

15. 如果樣品制備陽性對照或樣品制備陰性對照均得到預(yù)期陽性和陰性結(jié)果，說明樣品 制備操作有效，實驗結(jié)果有效。

16. 如果樣品制備陽性對照或樣品制備陰性對照任何一個沒有得到預(yù)期結(jié)果（如樣品制 備陽性對照無擴(kuò)增，或樣品制備陰性對照有擴(kuò)增），說明樣品制備操作無效或有污 染，實驗結(jié)果無效，需要重復(fù)樣品制備過程或請跟廠家聯(lián)系。