血吸蟲(chóng)通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Schistosoma spp.

產(chǎn)品及特點(diǎn)

血吸蟲(chóng)通用(Schistosoma spp.) 會(huì)引起血吸蟲(chóng)病，該病主要通過(guò)皮膚，黏膜與疫水接觸受染。患病后，侵襲期患者可有咳嗽、胸痛、偶見(jiàn)痰中帶血絲等癥狀，急性期臨床上常會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、痢疾樣大便且帶血和黏液、肝脾大、咳嗽、胸痛，血痰等癥狀，慢性期多因急性期未曾發(fā)現(xiàn)，未治療或治療不*，或多次少量重復(fù)感染等原因，逐漸發(fā)展而成，晚期病人極度消瘦，出現(xiàn)腹水、巨脾，腹壁靜脈怒張等晚期嚴(yán)重癥狀。感染該病對(duì)人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害，因此快速檢測(cè)血吸蟲(chóng)通用具有重要意義。熒光定量PCR是檢測(cè)傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門檢測(cè)血吸蟲(chóng)通用的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2.特異性高，引物是根據(jù)人血吸蟲(chóng)通用高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他細(xì)菌和微生物。

3. 引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無(wú)傳染性的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測(cè)，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

血吸蟲(chóng)通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3.在7號(hào)管中加入5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8.如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。如果用本試劑盒自帶的天凈沙DNA釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：
9.配制溶液A工作液。以配制1mL工作液（足夠10個(gè)樣品）為例：在一干凈塑料管中加入10μL溶液A成分一，20μL溶液A成分二和970μL超純水，充分混合均勻即可。溶液A工作液可室溫放置，但在一周內(nèi)用完，不要長(zhǎng)期放置。一次檢測(cè)一個(gè)樣品需要100μL溶液A工作液，1mL工作液足夠10個(gè)樣品。如果待測(cè)樣品數(shù)量為其他數(shù)字，配制的溶液A工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。
10.在標(biāo)記好的N+2個(gè)離心管中，加入1-5mg（半粒芝麻大?。┕腆w待測(cè)樣品或5μL液體待測(cè)樣品。在樣品制備陽(yáng)性對(duì)照中加入5μL陽(yáng)性對(duì)照，在樣品制備陰性對(duì)照中加入5μL水。
11.在每個(gè)管中加入100 μL溶液A工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。
12.95℃保溫10分鐘。
13.待冷卻到常溫后加入10μL溶液B并混勻得DNA釋放液。每個(gè)樣品得到的DNA釋放液足夠進(jìn)行50-100次PCR。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
14.如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
15.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

16.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理
17.設(shè)定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽(yáng)性。
18.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
19.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
五、電泳檢測(cè)
如果有必要電泳確認(rèn)，可取10-20 μL PCR產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的大小為400 bp。