沃爾巴克氏菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Wolbachia spp.

產(chǎn)品及特點

沃爾巴克氏菌(Wolbachia spp.)為革蘭氏陰性菌，又稱為沃爾巴克氏體，屬 于變形菌綱 Proteobacteria 的 α 亞門，立克次氏體科烏巴克體族烏巴克體屬中 的一種，1924 年由 Hertig 和 Wolbach 在尖音庫蚊 Culexpipiens 的生殖組織 里*被發(fā)現(xiàn)。沃爾巴克氏菌是自然界分布為廣泛的一種共生菌，在鞘翅目、 雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目、直翅目和嚙目等 10 多個目的 150 萬一 500 萬種昆蟲中都有共生。沃爾巴克氏菌感染昆蟲和其它節(jié)肢動物后，會導(dǎo) 致昆蟲和其他節(jié)肢動物無法產(chǎn)生雄性后代。21 世紀初，對沃爾巴克氏菌的研究 成為熱點?？茖W(xué)家們在積極尋找控制沃爾巴克氏菌的新方法或開發(fā)消滅沃爾巴克 氏菌的新藥物，原因在于一旦控制或消滅沃爾巴克氏菌則有可能消除或抑制病原 性宿主對人類、禽畜和作物造成的傷害。因此快速檢測沃爾巴克氏菌具有重要意 義。熒光定量 PCR 是檢測傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定 量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測沃爾巴克氏菌的試劑盒，它具有下列特點： 

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據(jù)人沃爾巴克氏菌高度保守區(qū)設(shè)計,不會擴增其他細菌和 微生物。 

3. 引物和擴增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

沃爾巴克氏菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的標準曲 線樣品的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或 第 5 號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定 量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)細菌 DNA 提取試劑 盒兼容。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果只做 1 次重復(fù)，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待 測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃 度。

五、電泳檢測

13. 如果有必要電泳確認，可取 10-20 uL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn) 物的大小為 400 bp。