纖維單胞菌熒光定量PCR試劑盒(探針法)

Cellulomonas spp. qPCR Kit(Probe Method)

產(chǎn)品簡介：

熒光定量 PCR 是檢測傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測纖維單胞菌的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)纖維單胞菌高度保守的 VP1 區(qū)設(shè)計(jì)。

5. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。

纖維單胞菌熒光定量PCR試劑盒(探針法)包裝規(guī)格及成分：

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：DNA 模板

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使用方法：

一.稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二.樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。?

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做 2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理
12.以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

六、電泳檢測 
13.如果有必要電泳確認(rèn)，可取 10-20 uL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn) 物的大小為 400 bp。

熒光定量PCR結(jié)果分析:
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，無法計(jì)算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了幾個(gè)重要的概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、CT值。