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DNA特異性細(xì)胞核實(shí)時(shí)成像試劑

NucleoSeeing ＜Live Nucleus Green＞

NucleoSeeing是與DNA特異性結(jié)合并發(fā)出綠色熒光的實(shí)時(shí)成像用細(xì)胞核染色試劑。不僅是動(dòng)物細(xì)胞和組織，擬南芥的葉細(xì)胞中也顯示出高S/N比，并可很好的觀察活細(xì)胞中細(xì)胞核動(dòng)態(tài)。另外，還可用作細(xì)胞核pH sensor。

※本產(chǎn)品基于名古屋工業(yè)大學(xué)的研究成果商品化而成。

※本產(chǎn)品僅供科研使用。嚴(yán)禁用于科研以外用途。

使用了NucleoSeeing的各種樣本的染色案例

將HeLa細(xì)胞（左），擬南芥表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞（中），小鼠腦海馬切片培養(yǎng)（右）活細(xì)胞成像后進(jìn)行觀察。詳情請(qǐng)參考各個(gè)案例的數(shù)據(jù)。

◆活細(xì)胞的細(xì)胞核成像

MEMO

細(xì)胞核作為DNA的儲(chǔ)存庫(kù)負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂和控制基因表達(dá)，是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一。因此細(xì)胞核動(dòng)力學(xué)的動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)成像就成為了非常重要的課題。從以前開(kāi)始就開(kāi)發(fā)了各種核染色試劑，雖然核酸應(yīng)答性的藍(lán)色熒光色素Hoechst系列和DAPI被廣泛運(yùn)用，但由于這些藍(lán)色熒光素使用紫外線作為激發(fā)光，光毒性強(qiáng)，存在不適用于活細(xì)胞成像的問(wèn)題。近，雖然開(kāi)發(fā)了一些適用于活細(xì)胞的核染料，如綠色和紅色熒光色素，但是化合物的細(xì)胞毒性和核染色的特異性仍然存在問(wèn)題。

NucleoSeeing是名古屋工業(yè)大學(xué)的筑地真也教授等人開(kāi)發(fā)的DNA特異性綠色熒光化合物，可以在細(xì)胞培養(yǎng)，組織培養(yǎng)以及擬南芥葉等的植物細(xì)胞中進(jìn)行活細(xì)胞成像。本產(chǎn)品細(xì)胞毒性低，DNA特異性顯示高S/N比，以及優(yōu)異的細(xì)胞核染色性能。也可用于觀察固定細(xì)胞，應(yīng)用靈活。另外，由于其擁有特殊的pH依存性熒光特性，還可以用作細(xì)胞核特異性的pH sensor。近年，在細(xì)胞核內(nèi)pH重要性的研究中，還可以期待本產(chǎn)品作為核內(nèi)pH檢測(cè)的試劑。

各種細(xì)胞核染料的比較參數(shù)

◆原理

NucleoSeeing是細(xì)胞膜滲透性的綠色核染色試劑，由綠色熒光色素和DNA特異性結(jié)合tag組成。本產(chǎn)品在DNA不存在時(shí)顯示折疊構(gòu)造，雖然有消光狀態(tài)，但與DNA結(jié)合時(shí)構(gòu)造發(fā)生改變，發(fā)出綠色熒光。由于NucleoSeeing攝入細(xì)胞內(nèi)后與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)出綠色熒光，因此可以特異性觀察細(xì)胞核。

◆特點(diǎn)

●　僅在與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)出綠色熒光，顯示高S/N比。由于在培養(yǎng)基中會(huì)消光，因此在添加了培養(yǎng)基的狀態(tài)下

●　也可以高靈敏度地進(jìn)行觀察

●　※想要提高靈敏度，則建議染色后更換培養(yǎng)基后再進(jìn)行觀察。

●　激發(fā)光/發(fā)射光波長(zhǎng)：488 nm/520 nm

●　和傳統(tǒng)的Hoechst等試劑相比，幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。

●　不僅僅是活細(xì)胞成像，還可以染色固定細(xì)胞，活細(xì)胞成像后再固定細(xì)胞進(jìn)行觀察，也可以用于免疫染色實(shí)驗(yàn)。

●　無(wú)論是動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞和組織培養(yǎng)，還是植物細(xì)胞（擬南芥葉細(xì)胞），都可以進(jìn)行高S/N比的核染色。

●　觀察植物細(xì)胞時(shí)，不受葉綠體來(lái)源的自身熒光（Em：>615 nm）的影響，可以?xún)H將細(xì)胞核可視化。

●　能夠可逆性染色。培養(yǎng)基更換12~24小時(shí)后，染料幾乎全部被排出細(xì)胞外。

●　由于可以看見(jiàn)pH依賴(lài)性的熒光強(qiáng)度的變化，所以在pH 6~8之間，可以通過(guò)2個(gè)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度比

●　（Ex 405 nm, Em 520 nm / 460 nm），作為細(xì)胞核內(nèi)的pH sensor使用。

◆應(yīng)用

●　動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)細(xì)胞的活細(xì)胞成像

●　植物細(xì)胞的活細(xì)胞成像

●　免疫染色中的細(xì)胞核染色

●　細(xì)胞核內(nèi)pH sensor（pH 6~8）

◆原著論文

※ 本產(chǎn)品NucleoSeeing是以下論文中的hoeAc₂FL。

◆應(yīng)用實(shí)例

DNA應(yīng)答性的熒光特性和細(xì)胞核特異性染色

左：NucleoSeeing僅在DNA存在時(shí)顯示出強(qiáng)的綠色熒光。激發(fā)光488 nm。

右：在活細(xì)胞中，與DNA特異性結(jié)合的Hoechst33342（藍(lán)）和NucleoSeeing（綠）進(jìn)行共染色的結(jié)果，

右：顯示出高度的一致性。

細(xì)胞毒性

作為藍(lán)色核染色試劑被廣泛使用的Hoechst33342和NucleoSeeing，利用MTT法確認(rèn)其細(xì)胞毒性。Hoechst在5 μM時(shí)觀察到了顯著的細(xì)胞死亡，而NucleoSeeing在5 μM時(shí)還未觀察到細(xì)胞毒性。

可逆性染色

為了評(píng)價(jià)Hoechst33342和NucleoSeeing的細(xì)胞滯留性，分別用1 μM兩種試劑處理15分鐘后，更換培養(yǎng)基，去除剩余的試劑，觀察24小時(shí)熒光強(qiáng)度的變化。Hoechst33342在24小時(shí)后依然維持80%的熒光強(qiáng)度，顯示出不可逆性，與之相對(duì)NucleoSeeing隨著時(shí)間推移，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，12小時(shí)以后幾乎全部排出。因此，NucleoSeeing可以作為可逆性的核染色試劑使用。

各種培養(yǎng)細(xì)胞的核染色

添加1 μM的 NucleoSeeing 至各種培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，染色15分鐘后，更換培養(yǎng)基觀察活細(xì)胞，無(wú)論哪種細(xì)胞都觀察到了核特異性的信號(hào)。

小鼠腦（海馬）切片培養(yǎng)組織的染色案例

添加20 μM 的NucleoSeeing至小鼠腦海馬切片培養(yǎng)組織的培養(yǎng)基中，染色15分鐘后，更換培養(yǎng)基在未固定的條件下進(jìn)行觀察。

固定細(xì)胞的染色案例

左：用4%多聚甲醛固定處理HeLa細(xì)胞后，用PBS清洗細(xì)胞，添加1 μM的 NucleoSeeing染色15分鐘。染色后，

右：清洗并觀察。

右：添加5 μM 的NucleoSeeing染色15分鐘，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞并進(jìn)行觀察。

右：※雖然也可用甲醇進(jìn)行固定，但信號(hào)可能會(huì)減弱。

擬南芥葉的保衛(wèi)細(xì)胞染色案例

用20 μM 的NucleoSeeing處理擬南芥葉的切片60分鐘后，清洗切片進(jìn)行觀察。激發(fā)光為488 nm時(shí)，在綠色熒光范圍490~555 nm內(nèi)觀察保衛(wèi)細(xì)胞的細(xì)胞核，615 nm以上波長(zhǎng)范圍中觀察到葉綠體來(lái)源的自身熒光。通過(guò)使用本試劑，可以在觀察時(shí)區(qū)分葉綠體的自身熒光和細(xì)胞核熒光，期待本品可作為植物細(xì)胞的核動(dòng)態(tài)成像試劑使用。

※擬南芥葉的保衛(wèi)細(xì)胞的核染色是由名古屋工業(yè)大學(xué)的筑地教授等人和東北大學(xué)上田實(shí)教授等人共同研究發(fā)現(xiàn)的成果。

Ueda, M., et al., ACS Cent. Sci., 3 (5), 462～472 (2017)

"Noncanonical function of a small-molecular virulence factor coronatine against plant immunity: an

 in vivo raman imaging approach."

擬南芥葉表皮細(xì)胞的染色案例

用20 μM的 NucleoSeeing處理擬南芥葉的切片60分鐘后，清洗切片進(jìn)行觀察。確認(rèn)表皮細(xì)胞的核特異性染色。

◆使用NucleoSeeing作為核內(nèi)pH sensor

細(xì)胞核有著由外膜和內(nèi)膜這兩層脂質(zhì)雙分子層膜構(gòu)成的核膜這種*結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞質(zhì)分隔開(kāi)來(lái)。細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)交流需要通過(guò)細(xì)胞核孔進(jìn)行，但學(xué)者們認(rèn)為細(xì)胞核內(nèi)的環(huán)境和細(xì)胞質(zhì)的環(huán)境是不同的。近年，有學(xué)者提出核膜中存在核膜特異性質(zhì)子泵（H⁺-ATPase），在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間產(chǎn)生質(zhì)子梯度。雖然可以期待通過(guò)生理現(xiàn)象變化來(lái)檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)的pH值，但是至今還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出十分理想的試劑。

名古屋工業(yè)大學(xué)筑地教授等人證明NucleoSeeing具有pH依賴(lài)性熒光特性，可以作為細(xì)胞核傳感器使用。NucleoSeeing作為細(xì)胞核染色試劑，一般在激發(fā)光480 nm/熒光520nm的范圍使用，但是在激發(fā)光405 nm時(shí)使用的話(huà)，在460 nm以及520 nm左右的熒光會(huì)依賴(lài)pH值發(fā)生變化。通過(guò)檢測(cè)激發(fā)光405 nm時(shí)460 nm和520 nm的熒光強(qiáng)度比（F520 / F460），觀察pH5.5～8.5之間的S形曲線。利用這個(gè)原理，就可以評(píng)估細(xì)胞核內(nèi)的pH值。

■　原著論文

Nakamura, A. and Tsukiji, S., Bioorg. Med. Chem. Lett., 27 (14), 3127～3130 (2017)

"Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using hoechst-tagged fluorescein."

◆NucleoSeeing用作細(xì)胞核內(nèi)pH sensor的原理和特點(diǎn)

（參考數(shù)據(jù)）in vitro中NucleoSeeing的pH依賴(lài)性熒光特性

左：在NucleoSeeing的激發(fā)波長(zhǎng)405 nm時(shí)熒光光譜和pH依賴(lài)性。在pH5.5~8.5之間，460 nm和520 nm附近的

左：熒光強(qiáng)度隨著pH值降低而增強(qiáng)。

右：在各pH值中，460 nm和520 nm的熒光強(qiáng)度F（激發(fā)波長(zhǎng)405 nm）和熒光強(qiáng)度比(F520 / F460)。

<注>NucleoSeeing針對(duì)活細(xì)胞用的細(xì)胞膜滲透性進(jìn)行了優(yōu)化，攝入細(xì)胞內(nèi)以后，被酯酶水解并轉(zhuǎn)化為活性本體。本數(shù)據(jù)是為了驗(yàn)證使用了化學(xué)合成的活性本體（NucleoSeeing的水解產(chǎn)物）進(jìn)行in vitro獲得的數(shù)據(jù)。請(qǐng)注意直接使用NucleoSeeing進(jìn)行in vitro不可能重現(xiàn)本數(shù)據(jù)。

◆在in cellulo中使用NucleoSeeing觀察細(xì)胞核內(nèi)pH

用NucleoSeeing染色培養(yǎng)細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）后，用含有K⁺ / H⁺離子載體Nigericin * 的pH buffer培養(yǎng)后，用共聚焦顯微鏡觀察在激發(fā)光405 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度比（F_Fluorescein / F_Hoechst）

左：各pH值的熒光觀察圖像

右：定量結(jié)果分析與in vitro相同，可以觀察到pH依賴(lài)性和熒光強(qiáng)度比的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并且預(yù)估生理性

右：（未添加Nigericin）的核內(nèi)pH值為7.4。

* Nigericin是代表性的K⁺ / H⁺離子載體，在細(xì)胞外溶液的pH值和細(xì)胞內(nèi)pH值一致時(shí)使用。

◆產(chǎn)品列表