真核生物中mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾在5′端形成一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對(duì) mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯過(guò)程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶，其由D1和D12兩個(gè)亞基組成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥(niǎo)苷酰基轉(zhuǎn)移酶活性和鳥(niǎo)嘌呤 甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可將7-甲基鳥(niǎo)嘌呤帽結(jié)構(gòu)(m7Gppp)連接到RNA的5′末端(m7Gppp5′N)。使用酶促反應(yīng)為RNA加帽是一種簡(jiǎn)單有效的方法，能顯著提高體外轉(zhuǎn)錄的RNA的穩(wěn)定性和翻譯能力。的摻入，合成與T7啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
本產(chǎn)品在合適濃度的加帽緩沖液（Capping buffer），鳥(niǎo)苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在條件下，能夠在一個(gè)小時(shí)之內(nèi)對(duì)RNA進(jìn)行加帽，效率可達(dá)到100%，并且保證加帽方向正確。
質(zhì)量保證：
1、SDS-PAGE膠檢測(cè)僅可見(jiàn)清晰單一的目的條帶，毛細(xì)管電泳檢測(cè)純度在95%以上；
2、酶動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)熒光法顯示無(wú)DNA酶及RNA酶污染；
3、光度測(cè)定法顯示內(nèi)毒素含量≤10 EU/mg。
產(chǎn)品用途：
1、可應(yīng)用于體內(nèi)/體外翻譯前mRNA的加帽反應(yīng)；
2、可應(yīng)用于mRNA的5’末端標(biāo)記反應(yīng)。
純度驗(yàn)證
RNA酶殘留定量檢測(cè)
| RFU值 | RFU平均值 | CV% | Ratio |
| VCE A | 28469 28580 | 28524.5 | 0.2752 | 1.76 |
| VCE B | 79995 78605 | 79300 | 1.2394 | 4.88 |
| VCE absin | 17845 17906 | 17875.5 | 0.2413 | 1.1 |
應(yīng)用實(shí)例
【加帽反應(yīng)】
適用于10µgRNA (>I00nt)的加用反應(yīng)，反應(yīng)體系20µL,且可根據(jù)實(shí)際需要放大。
1.取10µgRNA,用 RNase free water將適量 RNA稀釋 至15µL；
2.將RNA置于65℃加熱5min,結(jié)束后冰上放置5 min；
3.按照表格依次加入各組分；
4.37℃反應(yīng)30 min.
5.RNA加帽完成，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).
| 組分 | 體積 |
| Denatured RNA | 15µL |
| 10x Capping Reaction Buffer | 2µL |
| GTP(l0 mM) | 1µL |
| SAM (2 mM) | 1µL |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/µL) | 1µL |
| Total volume | 20µL |
應(yīng)用實(shí)例
【5′末端標(biāo)記反應(yīng)】
本步驟適用于5′末端帶有三磷酸的RNA標(biāo)記，且可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要放大。其標(biāo)記效率受反應(yīng)體系中RNA與 GTP摩爾濃度比以及RNA樣本中GTP含量影響。
1.用RNase Free Water將適量RNA稀釋至 14µL；
2.將RNA置于65℃加熱5 min,結(jié)束后冰上放置5 min；
3.按照表格依次加入各組分：
4.37℃孵育30 min；
5.RNA5′端標(biāo)記完成，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
*注：GTPMix為GTP和少量標(biāo)記物，GTP儲(chǔ)液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。
| 組分 | 體積 |
| Denatured RNA | 14 µL |
| IOx Capping Reaction Buffer | 2µL |
| GTP Mix | 2µL |
| SAM (2 mM) | 1µL |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/µL) | 1µL |
| Total volume | 20µL |
產(chǎn)品信息
| 貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 |
| abs60152 | 牛痘病毒加帽酶 | 500U/2000U/10000U |
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| abs60155 | Pseudo-UTP | 10ul/50ul/1ml |
| abs60156 | N1-Methyl-Pseudo-UTP | 10ul/50ul/1ml |
Absin特色產(chǎn)品線(全部現(xiàn)貨)：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))... |
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