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mRNA的5’端的帽子結(jié)構(gòu)可以提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、增強(qiáng)翻譯效率以及降低mRNA在細(xì)胞中的免疫原性【1】。作為mRNA的重要組成部分，帽子結(jié)構(gòu)可以稱得上是mRNA結(jié)構(gòu)的保護(hù)傘。那么，接下來(lái)我們就來(lái)學(xué)習(xí)一下帽子結(jié)構(gòu)。

• 帽子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

帽子結(jié)構(gòu)的化學(xué)本質(zhì)是mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)生修飾所形成的位于mRNA 5'端的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即m7GPPPN結(jié)構(gòu)，又稱甲基鳥(niǎo)苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA（鳥(niǎo)嘌呤-N7）甲基轉(zhuǎn)移酶和mRNA（核苷-2’）甲基轉(zhuǎn)移酶共同催化作用下形成的。甲基化程度的不同可形成3種帽子：CAP 0型、CAP 1型和CAP 2型（如圖1）。

 
圖1.不同位置甲基化形成的帽結(jié)構(gòu)【2】

帽子結(jié)構(gòu)是mRNA翻譯起始的必要結(jié)構(gòu)，為核糖體識(shí)別mRNA提供了信號(hào)，協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合，使翻譯從AUG開(kāi)始。同時(shí)帽子結(jié)構(gòu)可增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻擊。除去天然帽結(jié)構(gòu)，體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中也多用帽結(jié)構(gòu)類(lèi)似物提高mRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，常見(jiàn)的有ARCA和Cap 1結(jié)構(gòu)類(lèi)似物等。

• 加帽方式及對(duì)比

酶法加帽：使用加帽酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加帽，最常使用的是牛痘病毒加帽酶（VCE），該反應(yīng)過(guò)程中加帽酶的異源二聚體會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量較低，短期內(nèi)難以放大。特點(diǎn)：先轉(zhuǎn)錄后加帽，由于增加質(zhì)控項(xiàng)目工序繁雜（如圖2），加帽率*，但各類(lèi)酶成本較高。

共轉(zhuǎn)錄加帽：使用帽類(lèi)似物進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄加帽，目前常用的帽類(lèi)似物有兩種ARCA（抗-反帽結(jié)構(gòu)類(lèi)似物）和Cap1帽類(lèi)似物。有研究表明Cap 1結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)mRNA的翻譯效率，從而提高mRNA在轉(zhuǎn)染和顯微注射實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)。且隨著帽子結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化，加帽率大幅提升，成本逐漸降低，共轉(zhuǎn)錄加帽法越來(lái)越受各類(lèi)學(xué)者青睞。特點(diǎn)：一步法加帽，操作簡(jiǎn)單（如圖2），使用Cap 1結(jié)構(gòu)帽類(lèi)似物，加帽率可達(dá)95%，隨著帽結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究的深入，成本逐漸降低【3】。

 
圖2. 兩種加帽方式對(duì)比

• 三代帽子類(lèi)似物及其對(duì)比

第二代帽結(jié)構(gòu)傳統(tǒng)帽類(lèi)似物ARCA：Cap 0結(jié)構(gòu)非天然加帽，存在較強(qiáng)免疫原性，加帽率80%左右，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低約1.5mg/ml，成本高。

第三代帽結(jié)構(gòu)Cap1帽類(lèi)似物:  Cap 1結(jié)構(gòu)模仿天然加帽，免疫原性降低，加帽率95%左右，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低約4mg/ml，成本約為ARCA帽類(lèi)似物的三分之一。

• 愛(ài)必信提供幾種類(lèi)型CAP（AG/AU/GG）

• 帽結(jié)構(gòu)5月上新

除以上帽結(jié)構(gòu)，5月初我們即將重磅推出新修飾Cap 1帽結(jié)構(gòu)以及Cap 2帽結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的相關(guān)產(chǎn)品，敬請(qǐng)期待。

【參考文獻(xiàn)】：

• Fabian M, Nils M, Andrea R. Synthetic mRNA capping[J]. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2017, 13:2819-2832.

• Chen, Yu & Guo, Deyin. (2016). Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virologica Sinica. 31. 10.1007/s12250-016-3726-4.

• Henderson JM, Ujita A, Hill E, Yousif-Rosales S, Smith C, Ko N, McReynolds T, Cabral CR, Escamilla-Powers JR, Houston ME. Cap 1 Messenger RNA Synthesis with Co-transcriptional Clean Cap® Analog by In Vitro Transcription. Curr Protoc. 2021 Feb;1(2):e39. doi: 10.1002/cpz1.39. Erratum in: Curr Protoc. 2021 Dec;1(12):e336. PMID: 33524237.