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相信大家看著這個標(biāo)題，心情都是沉重的，尤其是對一些難養(yǎng)的類器官，好不容易養(yǎng)起來了，結(jié)果傳完代長不起來了，這是啥情況??？今天咱們從下面3個層面分析類器官傳代失敗原因。

影響類器官傳代因素

一、類器官傳代手法

影響類器官傳代最主要的因素是傳代手法。尤其是一些嬌貴的類器官，就像溫室的花朵，經(jīng)不起任何“風(fēng)雨"，比如基質(zhì)膠冷化條件（溫度及時長）、離心條件（溫度、轉(zhuǎn)速、時長）、棄除上清時的類器官丟失、消化條件（溫度、時長）、吹打力度對于它們來說就是“西天取經(jīng)路上的九九八十一難"。

（1）基質(zhì)膠冷化溫度、時長

類器官傳代時，我們需要把5-10孔（24孔板為例）的基質(zhì)膠和類器官混懸物用類器官傳代緩沖液(abs9730)吹散后收集到15mL離心管，并用類器官傳代緩沖液定容到14mL。接下來冷化基質(zhì)膠，可以選擇多種方式比如，4℃預(yù)冷30min； 0℃預(yù)冷30min；-20℃預(yù)冷5min。通常情況下，多數(shù)類器官都是可以采取上述三種方式，但少數(shù)類器官對溫度或時長過于敏感。對溫度過于敏感的類器官建議采用4℃預(yù)冷30min或0℃預(yù)冷30min；對時長過于敏感的類器官建議采用-20℃預(yù)冷5min。

（2）離心溫度、轉(zhuǎn)速、時長

離心對類器官可能造成的損傷主要包括：

A、機械應(yīng)力損傷：離心過程中產(chǎn)生的機械應(yīng)力可能會對類器官細(xì)胞造成破壞。這種損傷可能包括細(xì)胞膜的破裂、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的損傷，以及細(xì)胞功能的喪失。

B、溫度影響：離心時的溫度對類器官的保存狀態(tài)有重要影響。如果離心溫度過高，可能會導(dǎo)致基質(zhì)膠固化，影響類器官的分離和保存。因此，建議在4°C的低溫條件下進(jìn)行離心，以避免熱損傷。

基質(zhì)膠冷化后在進(jìn)行離心分層時，建議選用水平角離心機，轉(zhuǎn)速控制200g-300g，溫度設(shè)為4℃，時長控制在5min以內(nèi)。

（3）棄除上清時的類器官丟失

分層現(xiàn)象（緩沖液、基質(zhì)膠、類器官沉淀）

離心后的類器官正常是分層三層：緩沖液、基質(zhì)膠、類器官沉淀，正常我們是保留類器官沉淀層，上面的緩沖液和基質(zhì)膠去掉。但如果我們原代培養(yǎng)的類器官數(shù)量就很少，分層后的類器官沉淀層也會很少，這種情況下，我們不僅要保留類器官沉淀，還要保留基質(zhì)膠的下2/3，甚至基質(zhì)膠全層，以減少類器官的遺失（基質(zhì)膠層會殘留類器官）。點膠時保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上，以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性。

當(dāng)然，有時候離心后的類器官離心后也會出現(xiàn)兩層：緩沖液、基質(zhì)膠類器官混懸液。這種情況，建議保留基質(zhì)膠類器官混懸液下2/3，甚至基質(zhì)膠全層，以減少類器官的遺失（基質(zhì)膠層會殘留類器官）。點膠時保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上，以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性。

（4）消化溫度、時長

上述離心后的類器官懸液在進(jìn)行消化傳代時，那么要特別注意消化溫度、時長的控制。消化過度對類器官造成的損傷體現(xiàn)在兩個方面：

A、細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞死亡：消化過強可能會破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基中，引起細(xì)胞死亡。

B、細(xì)胞凋亡增加：胰酶消化時間過長，可能會增加細(xì)胞的凋亡率。因為過度的消化可能對細(xì)胞膜造成損傷，影響細(xì)胞表面受體蛋白的功能性和完整性。

雖然消化酶在37℃下活性最好，但消化效力太強對類器官不一定是好事，通常我們在室溫超凈臺內(nèi)進(jìn)行類器官消化就可以了，能更好地把控消化程度，及時根據(jù)鏡檢結(jié)果終止消化進(jìn)程。同時，消化時長建議2-3min即可（消化時間越長，可能會增加酶對類器官造成的損傷）。

（5）吹打力度

槍頭吹打在類器官培養(yǎng)中產(chǎn)生的主要有兩種力：機械損傷和剪切力。

A、機械損傷：這主要是指槍頭刮擦、細(xì)胞間相互碰撞等導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。為了減少這部分損傷，需要盡量減小吹打力度，只要保證能夠吹下吹散細(xì)胞就行。槍頭與細(xì)胞層接觸甚至研磨會導(dǎo)致細(xì)胞直接死亡，因此在操作時需要控制槍頭與培養(yǎng)板底的間距，避免直接接觸。

B、剪切力：剪切力是指物體橫截面受到外力影響，沿外力方向相對移動的現(xiàn)象，這個外力就叫做剪切力。 在細(xì)胞培養(yǎng)基里，如果有很多氣泡，細(xì)胞處在氣泡與培養(yǎng)基之間，當(dāng)氣泡破碎時，細(xì)胞瞬間會受到強大的剪切力影響從而導(dǎo)致細(xì)胞碎裂。

如果選擇機械吹打傳代方式，吹打的力度和次數(shù)對類器官活性影響很大。如果用1mL槍頭吹打，操作一定要輕柔，避免液流剪切力多類器官造成割傷，也可使用無菌巴適吸管代替槍頭，對類器官傷害小。同時吹打次數(shù)控制在30次以內(nèi)，可隨時鏡下觀察，一旦類器官從基質(zhì)膠中解離出來，并且有較多細(xì)胞團(tuán)塊，即可停止吹打。因此， 在進(jìn)行類器官吹打時，需要特別注意控制力度和技巧，以減少對細(xì)胞的損傷。

二、類器官本身

傳代后的肺癌類器官一周內(nèi)基本不長

（1）類器官活性強度

不同種類的類器官活性差異很大，活性比較強的類器官有子宮內(nèi)膜癌類器官、腸癌類器官，培養(yǎng)相對容易很多，連續(xù)傳代甚至可達(dá)30多代。然而有些類器官本身活性不足，比如甲狀腺癌類器官，只能維持原代，傳代后基本不長。除此以外，一致認(rèn)為難養(yǎng)的類器官還有肝癌類器官、前列腺癌類器官。

（2）類器官數(shù)量

如果在原代培養(yǎng)中類器官數(shù)量稀少，例如24孔板，每孔點50uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸物，長成的類器官數(shù)量低于20個，通常是類器官數(shù)量較少的情況。此時，如果傳代操作不當(dāng)，出現(xiàn)類器官大量丟失，就會導(dǎo)致傳下里的細(xì)胞團(tuán)密度過稀，缺少旁分泌信號調(diào)控，類器官增殖困難，出現(xiàn)長不大現(xiàn)象。因此，原代類器官數(shù)量多少也直接影響是否能順利傳代。

三、營養(yǎng)體系

（1）培養(yǎng)基

完quan培養(yǎng)基（添加因子）建議分裝儲存于-20℃，有效期長達(dá)1年；保存在4℃，建議2周內(nèi)用完，超過1個月，因子活性會逐漸下降。

4℃儲存太久（一個月以上）會導(dǎo)致培養(yǎng)基的效能下降，而效能下降又是怎樣影響類器官傳代效果的呢？

舉個例子：消化傳代前后使用的是同一瓶培養(yǎng)基，原代養(yǎng)得可以，傳代不行了。大家在推斷原因時可能會首先排除培養(yǎng)基問題，因為消化傳代前后使用的是同一瓶培養(yǎng)基，如果是培養(yǎng)基的問題，原代也養(yǎng)不好才對，而結(jié)果是原代養(yǎng)得好，傳代不好了。這里其實有大家想不到的因素存在。大家都知道類器官通常傳到一定代次會出現(xiàn)類器官增殖變緩（比如數(shù)量減少和體積縮?。?，就傳不下去了。因為類器官培養(yǎng)的成體干細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞，在經(jīng)歷多次傳代后，干性（自我更新和分化能力）都會逐代降低，最后就傳不下去。在類器官原代培養(yǎng)中，腫瘤干或成體干細(xì)胞干性很強，即便使用4℃儲存過久的培養(yǎng)基，依然可以增殖起來。而當(dāng)不斷傳代后，腫瘤干或成體干細(xì)胞干性逐漸下降，對培養(yǎng)基的因子活性需求就會提高，再使用4℃儲存過久的培養(yǎng)基就會難把類器官擴(kuò)增起來。

（2）類器官傳代消化液

消化液對類器官傳代的影響主要體現(xiàn)在2個方面：

A、傳代消化液是否恰當(dāng)，不合適的酶會造成類器官損傷。

B、傳代消化液建議分裝保存在-20℃，有效期長達(dá)1年，保存在4℃下，建議2周內(nèi)用完，超過1個月，酶活會逐漸下降。

首先，消化酶的消化力度還取決于酶的種類。我們嘗試過胰酶進(jìn)行類器官消化，發(fā)現(xiàn)胰酶對類器官的消化損傷比較大，不適合作為類器官傳代消化酶。所以，建議大家使用專用的類器官傳代消化液(abs9520)，其采用的多種溫和消化酶對類器官消化比較溫和。其次，消化液如果長時間存放于4℃，酶活會逐漸降低，消化類器官需要時間會想要增加，而增加消化時間，把控時長不當(dāng)，容易導(dǎo)致消化過度，使類器官活性受損。

（3）基質(zhì)膠

基質(zhì)膠建議分裝保存在-20℃，有效期長達(dá)1年，保存在4℃下，建議2周內(nèi)用完，超過1個月，基質(zhì)膠的粘附性和因子活性會逐漸下降。

基質(zhì)膠的作用有兩個，其一是起支架作用，維持類器官的橢球形態(tài)，其二是含有豐富的因子種類，對類器官的生長有促進(jìn)作用。當(dāng)基質(zhì)膠存4℃儲存時間過久，基質(zhì)膠的粘附性和因子活性均會大大降低，此時的基質(zhì)膠類器官穹頂結(jié)構(gòu)容易脫離培養(yǎng)板底面而漂浮，同時也難以維持類器官增殖需求。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！

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