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　　說(shuō)說(shuō)人表皮永生化細(xì)胞HACAT的培養(yǎng)步驟。

　　1、復(fù)蘇細(xì)胞：在37℃水浴中快速搖動(dòng)裝有1mL細(xì)胞懸液的冷凍管融化，加入5mL培養(yǎng)基并充分混合。在1000RPM下離心5分鐘，棄去上清液，加入4-6mL*培養(yǎng)基并充分吹掃。然后將所有細(xì)胞懸浮液添加到培養(yǎng)瓶中，并培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸浮液添加到6cm皿中）并培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換培養(yǎng)基，檢查細(xì)胞密度。

　　2、細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)到80％-90％，則可以傳代培養(yǎng)。
 

　　對(duì)于貼壁人表皮永生化細(xì)胞HACAT ，傳代可參考以下方法：

　?。?）棄去培養(yǎng)上清液，并用不含鈣和鎂離子的PBS沖洗細(xì)胞1-2次。

　?。?）向培養(yǎng)瓶中加入1-2ml消化液（0.25％胰蛋白酶-0.53mMEDTA），將其置于37℃的培養(yǎng)箱中1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況，如果大部分細(xì)胞旋轉(zhuǎn)并掉落后，迅速將其帶回手術(shù)臺(tái)，輕敲培養(yǎng)瓶幾次，并加入5ml以上含10％血清的*培養(yǎng)基終止消化。

　?。?）輕輕吹干細(xì)胞，然后將其*吸出。以1000RPM離心8-10分鐘，棄去上清液，加入1-2mL培養(yǎng)基并充分吹掃。

　?。?）加入5-6ml/瓶培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞懸液分成新的培養(yǎng)皿或瓶，其中裝有5-6ml培養(yǎng)液的比例為1：2至1：5。

　　對(duì)于懸浮人表皮永生化細(xì)胞HACAT，傳代可參考以下方法：

　?。?）收集細(xì)胞，以1000RPM離心8-10分鐘，棄去上清液，并加入1-2mL培養(yǎng)基吹凈，然后將細(xì)胞懸液分成新的培養(yǎng)皿或瓶，其中含有8ml培養(yǎng)基，比例為1：2至1：5。

　?。?）可以選擇一半的介質(zhì)更換方法。丟棄一半培養(yǎng)基后，懸浮剩余的細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮液分成新的含有8ml培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮液，比例為1：2至1：3。在盤子或瓶子里。

　　3、細(xì)胞凍存：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，可以將其冷凍保存。將貼壁細(xì)胞冷凍保存后，棄去培養(yǎng)基并加入少量胰蛋白酶。細(xì)胞變成圓形并脫落后，通過(guò)離心收集它們。