彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）也被稱為單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷的技術(shù)。當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性 DNA 損傷因子誘發(fā)細(xì)胞 DNA 鏈斷裂時(shí)，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA 以及其他成分均擴(kuò)散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進(jìn)入凝膠而留在原位。電泳過程中，如果DNA沒有損傷，則將停留在原位，染色后呈圓形的熒光團(tuán)，無拖尾出現(xiàn)。如果DNA受損，斷裂的碎片進(jìn)入到凝膠中，在電場(chǎng)的作用下，DNA碎片離開原位向陽極遷移，形成拖尾。DNA受損越嚴(yán)重，斷裂越多，產(chǎn)生的碎片就越多、越小，則向陽極遷移的DNA碎片量就越多，遷移距離也越長(zhǎng)，熒光染色后就能看見“彗星”樣尾長(zhǎng)并且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

目前有兩種常見的彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方式——堿性處理&中性處理。在堿性處理?xiàng)l件下，DNA發(fā)生變性，因而可檢測(cè)包括單鏈及雙鏈斷裂在內(nèi)的所有DNA 損傷；在中性處理?xiàng)l件下，DNA 維持雙鏈構(gòu)象，因而僅可以檢測(cè)雙鏈斷裂。

實(shí)驗(yàn)大體流程如下：

1. 制備單細(xì)胞懸浮液，在 37℃ 條件下，懸浮液與低熔點(diǎn)瓊脂糖（LM瓊脂糖）混合；

2. 將瓊脂糖、細(xì)胞混合物涂布在預(yù)處理的載玻片上；

3. 4℃條件下用裂解液處理30-60min或過夜，裂解液由去垢劑及高鹽溶液組成，可去除多余的細(xì)胞膜及組蛋白；

4. 將載玻片浸入電泳溶液中；

5. 進(jìn)行凝膠電泳，隨后，中和載玻片，待LM瓊脂糖*干燥后，用熒光染料染色，并于熒光顯微鏡下觀察DNA損傷程度。

注：常用的熒光染料是SYBR Gold，但熒光染料的觀察需要熒光顯微鏡。如果選擇銀染，使用標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)顯微鏡觀察即可。

圖片處理

在拍照時(shí)以tif格式保存圖片，然后用CASP彗星分析軟件分析，如下圖是軟件打開的界面?

接下來?導(dǎo)入圖片，用白色畫框選中要分析的區(qū)域。下圖中的“調(diào)整”項(xiàng)可以調(diào)整畫框的位置以包含整個(gè)細(xì)胞，開始分析前要點(diǎn)擊“開始”，然后點(diǎn)“分析”，再點(diǎn)“保存”，這樣一張圖的數(shù)據(jù)就分析完了，數(shù)據(jù)會(huì)保存在系統(tǒng)里。點(diǎn)擊“翻頁(yè)”可以繼續(xù)分析下一張圖。

分析完所有圖片后導(dǎo)出數(shù)據(jù)到Excel表格，保留TailDNA%（尾部DNA百分含量），TailLength（尾長(zhǎng)），TailMoment（尾矩）三列數(shù)據(jù)。根據(jù)細(xì)胞尾部的DNA百分含量（即TailDNA%），將采集的細(xì)胞圖像分為5級(jí)：彗星尾部熒光強(qiáng)度（TailDNA%）占總強(qiáng)度為0-6%是0級(jí)；6.1%-17.0%是1級(jí)；17.1%-35.0%是2級(jí)；35.1%-60.0%是3級(jí)；60.1%-100.0%是4級(jí)。

彗星率等于彗星細(xì)胞數(shù)目（除去0級(jí)細(xì)胞）占總細(xì)胞數(shù)目的百分比。任意值等于各等級(jí)細(xì)胞的百分比與其對(duì)應(yīng)的級(jí)別號(hào)的乘積之和，它可以綜合反映細(xì)胞的DNA損傷情況。后，綜合分析Tail DNA%、Tail length、Tail moment、彗星率和任意值，共5個(gè)指標(biāo)比較細(xì)胞的DNA損傷程度。

Trevigen作為一家專注于開發(fā)細(xì)胞凋亡、DNA損傷和修復(fù)、腫瘤細(xì)胞功能與行為等相關(guān)研究產(chǎn)品的美國(guó)生物技術(shù)公司，擁有彗星實(shí)驗(yàn)全線產(chǎn)品：

Trevigen是一家快速成長(zhǎng)的美國(guó)生物技術(shù)公司，專注于細(xì)胞凋亡、DNA損傷和修復(fù)、腫瘤細(xì)胞功能與行為等方面研究的腫瘤研究產(chǎn)品和服務(wù)。作為 Trevigen在中國(guó)區(qū)域的總代理，艾美捷與Trevigen一道為中國(guó)的科研工作者提供超好的氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷和腫瘤細(xì)胞行為研究等領(lǐng)域內(nèi)的 產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)。