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酶聯(lián)免疫斑點實驗 (enzyme linked immunospot assay, ELISpot) 是一種在96孔板內(nèi)的一百萬個細胞中實現(xiàn)對單個分泌細胞進行定量檢測的新型的免疫酶技術(shù)。靈敏度高,易操作,成本相對流式細胞術(shù)較低,已被廣泛應(yīng)用于癌癥研究,疾病探索以及疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。
ELISpot原理:將細胞置于包被有特異性抗體的96孔板中培養(yǎng),在有刺激的條件下,細胞分泌的細胞因子或免疫球蛋白會被包被抗體捕獲。移除細胞后,被捕獲的細胞因子可進一步使用生物素標記的二抗來標識,其后再與酶標記的親和素作用,并加入底物使其呈色,有反應(yīng)作用的細胞會留下直徑大小不等的染色斑點。
常見疑難問題解答:
1.推薦哪種ELISpot板子?
建議使用PVDF膜的96孔ELISpot板子,有效結(jié)合大量捕獲抗體,前提是膜用乙醇預(yù)處理(即活化)。
2.板的顏色是否重要,我應(yīng)選擇白色板子還是透明板子?
白色和透明ELISpot板具有相同類型的PVDF膜。這兩種顏色在讀板儀中略有不同,但并不重要。(如果有沒有添加液體的漏掉的孔,透明的板子很容易看見。)
3.包被前為什么要用乙醇對ELISpot板進行預(yù)處理?
ELISpot板子的膜具有多孔疏水結(jié)構(gòu)。為了使大量捕獲抗體能夠結(jié)合,應(yīng)該用乙醇處理膜以使其親水。這是獲得高質(zhì)量斑點所必需的致密抗體包被層。ELISpot板子的逐步預(yù)包被和EtOH處理的protocol。
4.冷凍細胞可以用于ELISpot嗎?
冷凍保存的細胞非常適合ELISpot。然而,其結(jié)果取決于細胞的質(zhì)量,必須建立冷凍/解凍的程序以產(chǎn)生具有高活力的細胞。標準冷凍程序應(yīng)包括使用DMSO和胎牛血清或類似物,并逐步冷凍程序。
5.在ELISpot中每孔使用多少個細胞?
必須將每個孔中的細胞數(shù)量調(diào)整為細胞類型和分泌細胞的預(yù)期頻率。如果頻率非常低,例如10,000個細胞中的1個,則需要更多數(shù)量的細胞,通常約250,000個細胞/孔。當(dāng)分泌細胞的頻率高時,例如10個細胞中的1個,約5,000個細胞/孔就足夠了。細胞數(shù)量在測定中并不總是顯示線性,因為需要細胞-細胞的zui佳接觸,例如抗原呈遞細胞的充分刺激。當(dāng)分析抗原特異性T細胞時,PBMC不應(yīng)低于每孔200,000個細胞。
通常不建議使用超過500,000個細胞/孔,因為這可能產(chǎn)生多個細胞層,反過來由于細胞和ELISpot膜之間的距離增加而導(dǎo)致斑點質(zhì)量降低。
6.可以在ELISpot中使用人血清嗎?
由于以下原因,不建議在ELISpot中使用人血清。當(dāng)分析人類樣品時,感興趣的分析物(例如IFN-γ或IgG)實際上可能存在于血清中。由于分析物將與捕獲和檢測抗體結(jié)合,因此會導(dǎo)致膜變暗。人血清可能含有嗜異性抗體,其可與來自許多物種的Ig交叉反應(yīng)。這種反應(yīng)可能會導(dǎo)致雙抗夾心免疫檢測中抗體交聯(lián)的問題。在ELISpot中,它將導(dǎo)致膜的普遍變暗。
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* 以上僅適用于科學(xué)研究使用.來源:艾美捷
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