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用途： EpiNext™ cTIP（CUT&Tag In-Place）測序試劑盒旨在從低輸入量的細(xì)胞/染色質(zhì)中富集特定蛋白（組蛋白或強(qiáng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子）-DNA復(fù)合物，并為使用Illumina平臺(tái)（如Illumina GenomeAnalyzer II、HiSeq和MiSeq系統(tǒng)）進(jìn)行下一代測序準(zhǔn)備文庫。該試劑盒的創(chuàng)新工作原理、優(yōu)化的協(xié)議和組分允許捕獲目標(biāo)蛋白/DNA復(fù)合物，Z小化非特異性背景水平，并快速構(gòu)建無條形碼（單重）和有條形碼（多重）文庫，以便以較少的偏差和高分辨率繪制目標(biāo)蛋白-DNA相互作用區(qū)域。

輸入量： 對(duì)于細(xì)胞，一般每反應(yīng)的量可以是2 x 10^3到2 x 10^5個(gè)細(xì)胞。為了Z佳準(zhǔn)備，細(xì)胞輸入量應(yīng)為1 x 10^5，盡管cTIP（CUT&Tag In-Place）測序試劑盒數(shù)據(jù)可以通過少至500個(gè)細(xì)胞獲得修飾組蛋白的數(shù)據(jù)。對(duì)于從細(xì)胞或組織中分離的染色質(zhì)，每反應(yīng)的量可以是0.1微克到5微克的染色質(zhì)。為了Z佳準(zhǔn)備，染色質(zhì)輸入量應(yīng)為2微克。

起始材料： 起始材料可以包括各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣本，如從培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞、原代細(xì)胞、從血液、體液和新鮮/冷凍組織中分離的稀有細(xì)胞群體、從整個(gè)細(xì)胞群體中分選的特定細(xì)胞和胚胎細(xì)胞等。

抗體： 抗體應(yīng)為ChIP級(jí)，以便識(shí)別與DNA或其他蛋白結(jié)合的蛋白。如果您使用的是未經(jīng)ChIP驗(yàn)證的抗體，則應(yīng)使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照抗體，如抗RNA聚合酶II、抗H3K4me3或抗H3K27me3，以證明抗體適合ChIP。

內(nèi)部對(duì)照： 該試劑盒中提供了陰性和陽性ChIP對(duì)照。

注意事項(xiàng)： 為避免交叉污染，仔細(xì)將樣品或溶液移液到PCR管中。使用防氣溶膠屏障移液管尖，并在液體轉(zhuǎn)移之間始終更換移液管尖。在整個(gè)過程中佩戴手套。如果手套與樣品接觸，立即更換手套。

CUT&RUN（目標(biāo)下切割與釋放使用核酸酶）和CUT&TAG（目標(biāo)下切割與標(biāo)記）是為有限生物材料的蛋白-DNA相互作用圖譜開發(fā)的方法。雖然它們顯著提高了圖譜分辨率，但兩者都成本高昂。此外，CUT&RUN需要昂貴的PA/Mnase融合蛋白，這種蛋白對(duì)A/T序列有顯著偏好，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白相互作用的DNA區(qū)域圖譜嚴(yán)重受到MNase消化水平的影響。除了與CUT&RUN相同的消化偏好外，由于Tn5轉(zhuǎn)座酶酶引起的染色質(zhì)的非目標(biāo)可及性，CUT&TAG的特異性較低。因此，作為一種改進(jìn)，我們開發(fā)了一種新技術(shù)：目標(biāo)下切割并就地標(biāo)記測序（CUT&Tag In-Place測序），用于繪制全基因組范圍內(nèi)的蛋白-DNA相互作用。

我們的創(chuàng)新方法結(jié)合了ChIPmentation、ChIP-exo和CUT&RUN的優(yōu)勢，并采用Z快的程序，將其整合到EpiNext™ cTIP（CUT&Tag In-Place）測序試劑盒中。

艾美捷CUT&Tag試劑盒特點(diǎn)：

1、高富集度：使用具有低序列偏好性的d特核酸切割酶混合液，同時(shí)將染色質(zhì)碎片化，并在不影響目標(biāo)蛋白占據(jù)的DNA的情況下，切割/移除目標(biāo)蛋白/DNA復(fù)合物兩端的任何DNA序列。因此，可以可靠地識(shí)別真正的目標(biāo)蛋白富集區(qū)域，并實(shí)現(xiàn)高分辨率映射。

2、低輸入材料：強(qiáng)大的無超聲碎片化、未結(jié)合DNA切割和免疫捕獲都在同一個(gè)單管中進(jìn)行，采用珠上連接。這種方法允許在細(xì)胞和組織中使用，并允許Z大限度地降解保護(hù)目標(biāo)蛋白，同時(shí)Z小化樣本損失。結(jié)果，輸入的細(xì)胞數(shù)量可以少至500個(gè)，或者染色質(zhì)量可以低至50納克。

3、就地標(biāo)記：在DNA純化之前，將DNA接頭珠上連接（就地）到染色質(zhì)，可以增加DNA片段大小，允許對(duì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（TF）的過短片段（例如：<70堿基對(duì)）進(jìn)行純化，以構(gòu)建文庫。

4、Z小背景：在原位切割目標(biāo)蛋白/DNA復(fù)合物兩端的未結(jié)合DNA序列，能夠Z小化免疫捕獲/測序背景，允許數(shù)據(jù)分析時(shí)讀取數(shù)少于1000萬次。

5、快速、簡化的程序：從細(xì)胞到文庫DNA的過程少于5小時(shí)。

6、高度方便：試劑盒包含CUT&Tag就地測序的每個(gè)步驟所需的所有組分，這些組分足以進(jìn)行蛋白/DNA捕獲和捕獲的DNA文庫準(zhǔn)備，從而使cTIP（CUT&Tag In-Place）測序試劑盒成為Z方便、可靠且結(jié)果一致的試劑盒。

CUT&Tag試劑盒檢測原理：

EpiNext™ cTIP（CUT&Tag In-Place）測序試劑盒包含了從哺乳動(dòng)物細(xì)胞開始進(jìn)行成功的cTIP-Seq所需的所有必要試劑。在反應(yīng)中，從細(xì)胞中分離出細(xì)胞核。目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物與感興趣的ChIP級(jí)抗體結(jié)合/捕獲。使用d特的核酸切割酶混合液，染色質(zhì)被碎片化，目標(biāo)蛋白/DNA復(fù)合物兩端的DNA序列被切割/移除。在此過程中，被目標(biāo)蛋白占據(jù)的DNA序列不受影響。接頭被連接到珠子上與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段。然后，連接的DNA被釋放、純化，并使用高保真PCR混合液進(jìn)行擴(kuò)增，以構(gòu)建文庫DNA。DNA隨后被清潔、釋放和洗脫。試劑盒中包括一個(gè)陽性對(duì)照抗體（抗H3K9me3）、一個(gè)陰性對(duì)照非免疫IgG和對(duì)照染色質(zhì)，這些可以用來在PCR/生物分析儀步驟中展示試劑盒的效果和性能。

EpiNext™ cTIP（CUT&Tag In-Place）測序試劑盒的工作流程。