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WRN解旋酶活性測定試劑盒是一種熒光測定法,旨在通過監(jiān)測WRN(Werner綜合征ATP依賴性Helicase)拮抗劑/抑制劑對WRN催化的DNA解旋的影響來篩選和分析WRN拮抗劑/抑制劑。WRN Helicase活性檢測試劑盒采用方便的96孔格式,含有足夠的純化重組WRN、ATP、DNA底物、檢測緩沖液和添加劑,可用于100個反應(yīng)。
艾美捷WRN解旋酶活性測定試劑盒:
貨號: BPS-78852
同義詞:雙功能3'-5'外切酶/ATP依賴性解旋酶WRN,DNA解旋酶,RecQ樣型3,RecQ蛋白樣2,Werner綜合征蛋白,ATP依賴性解旋酶,3'-5'外切酶,RECQ3,RECQL2
檢測試劑盒格式:熒光法
物種:人類
需自備材料:能夠讀取激發(fā)波長/發(fā)射波長=525 nm/592 nm的熒光微孔板閱讀器。
UniProt :#Q14191
儲存/穩(wěn)定性:如果按照指示儲存材料,該檢測試劑盒從收到之日起最佳性能可維持長達6個月。
應(yīng)用:篩選影響WRN解旋酶活性的小分子抑制劑或拮抗劑,在高通量篩選(HTS)應(yīng)用中。
運輸溫度:-80°C
注:反應(yīng)中DMSO的最終濃度不應(yīng)超過1%。
WRN解旋酶活性測定試劑盒檢測協(xié)議:
所有樣品和對照應(yīng)成對進行。
檢測應(yīng)包括“陰性對照"、“陽性對照"和“試驗抑制劑"條件。
我們建議在實驗中將稀釋后的蛋白質(zhì)保持在冰上。
有關(guān)蛋白質(zhì)處理的詳細信息,請參閱蛋白質(zhì)常見問題解答,
我們推薦使用HRO761作為內(nèi)部對照。如果不對控制抑制劑進行劑量反應(yīng)曲線測試,我們建議按照下面驗證數(shù)據(jù)中顯示的IC50值的0.1倍、1倍和10倍來運行控制抑制劑。
準備4倍濃縮WRN緩沖液:向4毫升4倍WRN緩沖液中加入40微升0.5M DTT并混勻。
準備1倍WRN緩沖液:用蒸餾水將1毫升4倍濃縮WRN緩沖液稀釋4倍?;靹?。
在冰上解凍WRN。短暫離心含有蛋白質(zhì)的管子以回收管子的全部內(nèi)容物。
將WRN用1倍WRN緩沖液稀釋至5納克/微升。每個孔需要40微升。
向“陽性對照"和“試驗抑制劑"孔中各加入40微升稀釋后的WRN。
向“陰性對照"孔中加入40微升1倍WRN緩沖液。
準備試驗抑制劑(每個孔5微升):對于滴定,準備比期望最終濃度高10倍的連續(xù)稀釋。反應(yīng)的最終體積為50微升。
向“試驗抑制劑"孔中加入5微升試驗抑制劑。
向“陰性對照"和“陽性對照"孔中各加入5微升溶劑溶液。
輕輕晃動板子,然后在室溫(RT)下孵育15-20分鐘。
解凍ATP(200 mM)并保持在冰上。
將ATP在1倍WRN緩沖液中稀釋5倍至40 mM濃度。每個孔需要2.5微升。注意:將未使用的ATP分裝成單次使用的小份,并立即存放在-80°C。
在冰上解凍WRN底物。短暫離心含有WRN底物的管子以回收管子的全部內(nèi)容物。
將WRN底物在1倍WRN緩沖液中稀釋12.5倍。每個孔需要2.5微升。注意:將未使用的WRN底物分裝成單次使用的小份,并立即存放在-80°C。
準備主混合物,按1:1的比例混合稀釋后的ATP(40 mM)和稀釋后的WRN底物,如下:N個孔 × (2.5微升稀釋后的WRN底物 + 2.5微升稀釋后的ATP)。
通過向所有孔中加入5微升上述制備的主混合物來啟動反應(yīng)。
輕輕晃動板子,并立即放入能夠讀取λexc/λem=525 nm/592 nm的熒光微孔板閱讀器中。
在25分鐘后讀取終點熒光,或在加入主混合物后使用動力學(xué)模式讀取幾個時間點。推薦的時間間隔為5分鐘。
通過從其他值中減去“陰性對照"的值來計算結(jié)果。
WRN解旋酶活性測定試劑盒示例結(jié)果:
圖:WRN的滴定。在WRN和2 mM ATP含量增加的情況下測量熒光。
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