大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶IV（top4）是一種II型拓?fù)洚惍悩?gòu)酶，由大腸桿菌中的parC和parE兩個(gè)基因編碼。這種酶對(duì)大腸桿菌的脫鏈和染色體分離至關(guān)重要；因此，拓?fù)?span style="font-family: Calibri;">IV傾向于更喜歡分子間鏈傳遞（鏈?zhǔn)胶兔撴湻磻?yīng)）而不是弛豫反應(yīng)。EC拓?fù)洚悩?gòu)酶IV也是喹諾酮類(lèi)抗菌劑的靶標(biāo)，喹諾酮類(lèi)抗菌藥通過(guò)將酶轉(zhuǎn)化為DNA損傷劑來(lái)發(fā)揮作用。TopoGEN提供純化的Top4，用于藥物開(kāi)發(fā)和篩選分析的各個(gè)方面。該酶在解鏈動(dòng)基質(zhì)DNA（kDNA）中非?；钴S，但也會(huì)松弛超螺旋質(zhì)粒DNA。然而，它在放松活動(dòng)中不太穩(wěn)健。根據(jù)Peng和Marians的方法純化大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶IV。

艾美捷TopoGEN大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶IV：

編號(hào)：TG2000EC

分類(lèi)：拓?fù)涿?/span>

標(biāo)簽：拓?fù)洚悩?gòu)酶

包含材料：包含兩部分的測(cè)定緩沖液和稀釋緩沖液。

EC拓?fù)涿?span style="font-family: Calibri;">IV在干冰上運(yùn)輸，應(yīng)儲(chǔ)存在-70°C。我們還建議在s次解凍后分裝酶。請(qǐng)注意，反復(fù)的凍融會(huì)導(dǎo)致活性損失。

拓?fù)洚悩?gòu)酶IV質(zhì)量控制測(cè)試：

Top4通過(guò)已發(fā)表的方法（2）過(guò)表達(dá)并純化。每個(gè)亞基在SDS-PAGE上通過(guò)CB染色檢測(cè)到單一條帶。通過(guò)在優(yōu)化的I型活性條件下對(duì)超螺旋DNA的松弛進(jìn)行測(cè)定，評(píng)估了與拓?fù)洚悩?gòu)酶I的交叉污染。在這些條件下，與pBR322孵育2小時(shí)后，未檢測(cè)到任何松弛產(chǎn)物。

拓?fù)洚悩?gòu)酶IV解鏈測(cè)定，EC拓?fù)涿?span style="font-family: Calibri;">IV，top4解鏈測(cè)定

拓?fù)洚悩?gòu)酶IV測(cè)定條件

反應(yīng)包含以下成分（20微升）：40 mM Tris-HCl（pH 7.5），6 mM MgCl2，10 mM DDT，100 mM 鉀谷氨酸，40 uM ATP，50 ug BSA/ml，0.2 ug kDNA。反應(yīng)在37°C下進(jìn)行30分鐘后，用SDS（1%）終止，隨后用蛋白酶K消化（50 ug/ml，56°C下15分鐘）。反應(yīng)產(chǎn)物在含有0.5 ug/ml乙酰胺的1%瓊脂糖凝膠上電泳（用手持紫外線燈監(jiān)測(cè)以分辨解鏈產(chǎn)物），用蒸餾水脫色（室溫下20分鐘）并拍照。

TopoGEN大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶IV評(píng)論和引用：

Phillips JW, Goetz MA, Smith SK, Zink DL, Polishook J, Onishi R, Salowe S, Wiltsie J, Allocco J, Sigmund J, Dorso K, Lee S, Skwish S, de la Cruz M, Martin J, Vicente F, Genilloud O, Lu J, Painter RE, Young K, Overbye K, Donald RGK, Singh SB: Discovery of Kibdelomycin, A Potent New Class of Bacterial Type II Topoisomerase Inhibitor by Chemical-Genetic Profiling in Staphylococcus aureus.  Cell Chemistry and Biology 2011, 18: 955-965.  doi: 10.1016/j.chembiol.2011.06.011.

Peng, H., and Marians, K. (1999). DNA Topoisomerase Protocols Volume I; page 163.

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