測量IGFBP-3

目前所有的IGFBP-3免疫分析法都使用特定的抗IGFBP-3抗體的結(jié)合來產(chǎn)生信號，從而實(shí)現(xiàn)IGFBP-3的定量。在這個(gè)系統(tǒng)中，無法避免區(qū)分完整的IGFBP-3分子和它們各自的片段（由于不同蛋白酶活性生理性地產(chǎn)生）。因?yàn)橐粋€(gè)IGFBP-3分子可以被切割成幾個(gè)片段，所以經(jīng)常測量到虛假的高定量值?；谶@種方法，無法區(qū)分高IGFBP-3水平或高度片段化。嘗試使用只由完整的IGFBP-3分子表示的結(jié)合區(qū)域的單克隆抗體是間接的、不精確的和不充分的，因?yàn)樗杏行У牡鞍酌傅幕顒?dòng)（它們有不同的作用位點(diǎn)，因此產(chǎn)生不同類型的片段）會(huì)被忽視。

然而，IGFBP-3（生物活性）ELISA能夠確定功能性和生物活性的IGFBP-3；功能性是指與主要天然配體，即IGF-I的結(jié)合能力。新的測試原理（z利申請中DE19719001）使用固定在微孔板上的抗IGFBP-3抗體和生物s標(biāo)記的IGF-I作為配體。樣本中的IGFBP-3與微孔板結(jié)合，并且當(dāng)同時(shí)被IGFBP-3結(jié)合時(shí)，生物s標(biāo)記的IGF-I提供了測試的特定信號。因此，只有功能性IGFBP-3被定量。z利的測試格式確保了在簡單的格式中的可靠性能，就像傳統(tǒng)的ELISA試劑盒一樣。先進(jìn)且耗時(shí)和勞動(dòng)密集型的生化分析（例如，通過尺寸色譜或西方印跡等）已經(jīng)變得多余，這些分析方法也只能估計(jì)濃度。

該酶免疫測定試劑盒用于研究，可定量人血清、肝素血漿或腦脊液中的生物活性IGFBP-3。僅供研究使用。不用于診斷程序。

作為ALPCO在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦ALPCO熱銷產(chǎn)品IGFBP-3(生物活性)ELISA試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

IGFBP-3(生物活性)ELISA試劑盒檢測原理：

IGFBP-3（生物活性）ELISA利用固定在微孔板上的特異性和高親和力的IGFBP-3抗體。配體，生物s標(biāo)記的IGF-I預(yù)先以過量的方式分裝在所需的孔中。樣本用特殊的稀釋液（樣本緩沖液PP）稀釋，從而釋放所有自然結(jié)合的IGFs從其結(jié)合蛋白上。通過向含有配體的孔中加入含有游離IGFBP-3的稀釋樣本的等分，生物s標(biāo)記的IGF-I占據(jù)了IGFBP-3的所有現(xiàn)有特定結(jié)合位點(diǎn)。通過使用鏈霉親和素-過氧化物酶（POD）綴合物，只有IGFBP-3/生物s標(biāo)記IGF-I的復(fù)合物參與信號產(chǎn)生（通過POD底物反應(yīng)），因此，只有功能性IGFBP-3被定量。標(biāo)準(zhǔn)品由天然和功能性的人類IGFBP-3制成，濃度分別為0.4、2、6、15和30 ng/mL。

測定程序注意事項(xiàng)：所有測定（標(biāo)準(zhǔn)品、對照血清和樣本）應(yīng)以雙份進(jìn)行。為了獲得最佳結(jié)果，建議準(zhǔn)確移液并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。在進(jìn)行測定時(shí)，應(yīng)盡可能快地移液標(biāo)準(zhǔn)品、對照血清和樣本（例如，<15分鐘）。為了避免由于孵育時(shí)間差異導(dǎo)致的變異，酶結(jié)合物、底物溶液S以及終止液SL應(yīng)分別按照相同的順序和時(shí)間間隔添加到板中。

1) 請將配體結(jié)合物L(fēng)K用稀釋液VP稀釋1:101（如果需要使用整個(gè)微孔板，可能需要4.8 mL，因此將60 ?L濃縮的LK與6 mL緩沖液VP稀釋）。

2) 向每個(gè)孔中加入50 ?L已經(jīng)稀釋1:101的配體結(jié)合物L(fēng)K。

3) 在A1/2位置（=空白孔）中加入50 ?L樣本緩沖液PP。

4) 分別向B1/2位置中加入50 ?L標(biāo)準(zhǔn)品A（0.4ng/mL），向C1/2位置中加入50 ?L標(biāo)準(zhǔn)品B（2 ng/mL），向D1/2位置中加入50 ?L標(biāo)準(zhǔn)品C（6 ng/mL），向E1/2位置中加入50 ?L標(biāo)準(zhǔn)品D（15 ng/mL），向F1/2位置中加入50 ?L標(biāo)準(zhǔn)品E（30 ng/mL）。為了控制測試的正確執(zhí)行，可以在G1/2和H1/2位置中分別加入50 ?L稀釋的對照血清KS1和KS2（通常在樣本緩沖液PP中稀釋1:505）。

根據(jù)要求，在其余孔中分別加入50 ?L稀釋后的樣本（通常在樣本緩沖液PP中稀釋1:505）。請?jiān)跇颖炯尤牒罅⒓椿旌舷♂屢?，并?0分鐘內(nèi)使用。

5) 用密封膠帶覆蓋孔，并在室溫下孵育板2小時(shí)（350 rpm振蕩）。

6) 孵育后，吸去孔內(nèi)的內(nèi)容物，并用300 ?L洗滌液WP洗滌孔5次。

7) 在最后一次洗滌步驟后，向每個(gè)孔中加入100 ?L已經(jīng)稀釋1:101的酶結(jié)合物EK（如果需要使用整個(gè)微孔板，可能需要9.6 mL，因此可以將120 ?L濃縮的EK與12 mL緩沖液VP稀釋）。

8) 用密封膠帶覆蓋孔，并在室溫下孵育1小時(shí)（350 rpm振蕩）。

9) 孵育后，按照步驟6的描述，用洗滌液WP洗滌孔5次。

10) 向每個(gè)孔中加入100 ?L TMB底物溶液S。

11) 在室溫下黑暗中孵育板30分鐘。

12) 孵育后，向每個(gè)孔中加入100 ?L終止液SL。

13) 在30分鐘內(nèi)測量450 nm處的吸光度（參考濾光片≥ 590 nm）。

文獻(xiàn)參考：

1) Ballard J, Baxter R, Binoux M, Clemmons D, Drop S, Hall K, Hintz R, Rechler M, Rutanen E, Schwander J(1989) On the nomenclature of the IGF binding proteins. Acta Endocrinol (Copenh) 121:751-752

2) Wilson EM, Oh Y, Rosenfeld RG (1997) Generation and characterization of an IGFBP-7 antibody:Identification of 31 kD IGFBP-7 in human biological fluids and Hs578T human breast cancer conditionedmedia. J Clin Endocrinol Metab Vol 82, 4:1301-1303

3) Baxter RC (1988) Characterization of the acid-labile subunit of the growth hormone-dependent insulin-likegrowth factor binding protein complex. J Clin Endocrinol Metab 67:265-272

4) Baxter RC, Martin JL (1989) Structure of the Mr 140,000 growth hormone dependent insulin-like growthfactor binding protein complex: determinati-on by reconstitution and affinity-labeling. Proc Natl Acad Sci USA86:6898-6902

ALPCO產(chǎn)品種類多樣，可測樣品來源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、豬、羊、狗、猴等，涉及神經(jīng)生物學(xué)、骨代謝、心血管疾病和氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖尿病和肥胖癥、內(nèi)分泌學(xué)、甲狀腺功能、腸胃病學(xué)、免疫學(xué)、生殖激素、抗體和抗原、分子診斷等多個(gè)研究領(lǐng)域，尤以糖尿病和肥胖癥研究領(lǐng)域見長。

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