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基因篩選與蛋白檢測(cè)是近年來(lái)備受矚目的創(chuàng)新前沿技術(shù)，在探索疾病相關(guān)基因及其表達(dá)的蛋白在特定生理、病理、發(fā)育等過(guò)程中所起的功能時(shí)發(fā)揮重要作用，正成為診斷與治療血液病、腫瘤、遺傳病等疾病的有利工具。
 
Sanger矩陣型CRISPR文庫(kù)——讓基因篩選更
 
2012年，基因編輯技術(shù)CRISPR橫空出世，以其簡(jiǎn)易、的特征迅速成為該領(lǐng)域的新寵。CRISPR技術(shù)以引導(dǎo)RNA（gRNA）識(shí)別靶序列，以單個(gè)蛋白Cas9切斷DNA雙鏈，終實(shí)現(xiàn)基因的*沉默?；谶@一的特征，CRISPRZhang Feng團(tuán)隊(duì)等迅速將其應(yīng)用于全基因功能*沉默的篩選。經(jīng)過(guò)幾年的高速發(fā)展，基于CRISPR的全基因篩選有效減少篩選中的脫靶現(xiàn)象，避免關(guān)鍵基因的遺漏，已隱隱有超越shRNA模式的態(tài)勢(shì)。初，科學(xué)家使用的是集合型文庫(kù)，集合型全基因文庫(kù)的出現(xiàn)，幫助人們實(shí)現(xiàn)了對(duì)全基因水平的功能*缺失的篩選?？茖W(xué)家們利用CRISPR/Cas9集合型文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)黑色素瘤耐藥關(guān)鍵基因1，實(shí)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)與遷移的在體篩選2，甚至發(fā)現(xiàn)病毒感染人類的關(guān)鍵基因3。

 
2016年科技界創(chuàng)新"奧斯卡獎(jiǎng)"R&D 100大獎(jiǎng)授予了Sanger矩陣型CRISPR文庫(kù)。由Merck公司與Sanger研究所聯(lián)合推出的這款CRISPR矩陣型文庫(kù)，突破"篩選方式限于細(xì)胞分群實(shí)驗(yàn)、依賴低MOI慢病毒介導(dǎo)、數(shù)據(jù)分析必須通過(guò)二代測(cè)序"等CRISPR集合型文庫(kù)的局限性，為科學(xué)家們帶來(lái)了技術(shù)革新的福音：篩選策略不再受限于正向或反向篩選，而是可以使用各類細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)作為數(shù)據(jù)讀出結(jié)果?？茖W(xué)家們爭(zhēng)先鞏后利用CRISPR/Cas9矩陣型文庫(kù)實(shí)現(xiàn)功能基因的大規(guī)模敲除4，構(gòu)建GPI調(diào)控蛋白的全基因篩選模型5，大大加速了科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)流程。

 
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看得見(jiàn)的蛋白互作新技術(shù)Duolink® PLA®——讓蛋白檢測(cè)更
 
腫瘤、高血壓、糖尿病，人類面臨著與疾病賽跑的巨大壓力。如何利用蛋白生物標(biāo)志物加速對(duì)疾病致病機(jī)理的探究過(guò)程，診斷有效預(yù)后是科學(xué)家與醫(yī)學(xué)工作者們研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。傳統(tǒng)的蛋白研究方法如Co-IP、Western blot、ELISA、IF等因檢測(cè)靈敏度低、假陽(yáng)性高、適用樣本范圍窄等原因而呈現(xiàn)出極大的局限性。
看得見(jiàn)的蛋白互作新技術(shù)Duolink® PLA® 的出現(xiàn)給科研工作者帶來(lái)更大的可能性。Duolink® PLA®可實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)別的蛋白互作檢測(cè)，特異性放大信號(hào)1000倍，實(shí)現(xiàn)了可視化原位定量檢測(cè)細(xì)胞生理水平的微量蛋白的微弱互作和修飾。目前，Duolink® PLA® 技術(shù)已在腫瘤學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、表觀遺傳學(xué)、生殖發(fā)育、組織病理學(xué)、心血管、代謝等研究領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛報(bào)道。
 

 
應(yīng)用1：Duolink® PLA®在微量細(xì)胞中的微弱蛋白互作檢測(cè)，解決Co-IP技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用
在神經(jīng)生物學(xué)研究中，很多時(shí)候研究的起始材料包括細(xì)胞、組織等非常微量，同時(shí)相互作用的蛋白也很微弱，超出了傳統(tǒng)方法如CO-IP的檢測(cè)靈敏度。在神經(jīng)生物學(xué)研究中，DYX1C1是閱讀障礙的易感基因，與神經(jīng)元遷移有關(guān)，但是并不清楚它們之間的功能與相關(guān)性。
下圖顯示原代大鼠胚胎海馬神經(jīng)元使用雌二醇培養(yǎng)48h，PLA檢測(cè)雌激素受體ERs/DYX1C1在神經(jīng)突觸中的相互作用（A和D為雌二醇（E2）刺激組，B和E為未刺激組，C和F為無(wú)抗體陰性對(duì)照），每一個(gè)紅點(diǎn)代表ERs/DYX1C1相互作用的復(fù)合物，藍(lán)色代表 Hoechst染細(xì)胞核，綠色代表Actin蛋白。作者使用傳統(tǒng)Co-IP方法并沒(méi)有在胚胎神經(jīng)元中檢測(cè)到相互作用的復(fù)合物。通過(guò)PLA技術(shù)，對(duì)DYX1C1的功能有新的理解，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元遷移，閱讀障礙與雌性激素信號(hào)通路的聯(lián)系，從而影響腦發(fā)育，調(diào)節(jié)認(rèn)知功能。
 
 

 
 
應(yīng)用2：Duolink® PLA®在病理組織中蛋白相互作用的原位檢測(cè)，解決IHC無(wú)法實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用
在腫瘤的靶向治療過(guò)程中，BRAF是非常重要的藥物靶點(diǎn)，很多腫瘤都存在BRAF(V600)的突變，很多藥物都是針對(duì)這個(gè)位點(diǎn)，但是逐漸增加的藥物抗性讓大家迫切希望能夠進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)，和傳統(tǒng)藥物聯(lián)合治療，進(jìn)一步提高藥物治療效果。
下圖是發(fā)表在Nature上的文章，研究者從藥物產(chǎn)生抗性的機(jī)理出發(fā)，針對(duì)抗性相關(guān)的信號(hào)通路中共同的復(fù)合物eIF4F，開(kāi)發(fā)了Duolink® PLA®原位技術(shù)在細(xì)胞以及臨床病人的病理組織樣本進(jìn)行大量的檢測(cè)的方法。圖中顯示與anti-BRAF治療前的腫瘤相比，eIF4F復(fù)合物的形成比率在免疫應(yīng)答的腫瘤中降低，在抗藥性轉(zhuǎn)移的腫瘤中復(fù)合物形成比率升高，圖中每個(gè)棕色的點(diǎn)狀信號(hào)代表一個(gè)相互作用復(fù)合體。因此eIF4F能夠作為先天（innate）和獲得性（acquired）抗性的指示器，也能作為抗腫瘤治療的靶標(biāo)。通過(guò)封閉eIF4E–eIF4G相互作用或靶向eIF4A，能夠抑制eIF4F復(fù)合物的形成，從而協(xié)同抑制BRAF(V600)，消除腫瘤細(xì)胞。
PLA技術(shù)作為病理組織學(xué)研究的第二代新技術(shù)，在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及性，是傳統(tǒng)IHC實(shí)驗(yàn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，能夠建立高質(zhì)量建立病樣組織標(biāo)本庫(kù)。
 

 
應(yīng)用3．Duolink® PLA®在單細(xì)胞水平分析組蛋白的修飾，解決ChIP研究中無(wú)法實(shí)現(xiàn)結(jié)果的應(yīng)用
表觀遺傳學(xué)是當(dāng)前眾多研究中非常熱點(diǎn)的方向，而ChIP又是表觀遺傳學(xué)中重要的技術(shù)之一，能很好地理解組蛋白修飾在基因調(diào)控中的作用，但ChIP無(wú)法在單細(xì)胞水平上進(jìn)行研究。
下圖發(fā)表在Nature上的文章，將PLA技術(shù)與原位雜交（ISH）技術(shù)聯(lián)合起來(lái)開(kāi)發(fā)出新的ISH-PLA技術(shù)，能夠在石蠟切片的組織樣本中，對(duì)特定類型單細(xì)胞中的特定基因位點(diǎn)的組蛋白修飾進(jìn)行可視化研究，圖中箭頭表示在人頸動(dòng)脈和腦組織中的組蛋白修飾的PLA信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)在人和小鼠的組織中MYH11位點(diǎn)的H3K4me2被限制在平滑肌細(xì)胞中，ISH-PLA 能夠準(zhǔn)確、特異性地檢測(cè)人和小鼠組織中單個(gè)細(xì)胞的特定基因位點(diǎn)的組蛋白修飾。該研究次在復(fù)雜的多種類型細(xì)胞存在的完整組織樣本中，在內(nèi)源性水平鑒定了特定細(xì)胞和基因位點(diǎn)組蛋白修飾，顯示在體內(nèi)SMC細(xì)胞中MYH11基因H3K4me2*和重要的表觀特征，表明PLA技術(shù)可以很方便地適用于單細(xì)胞水平組蛋白修飾和多個(gè)基因位點(diǎn)的檢測(cè)。
 

1.  Ophir Shalem, Neville E. Sanjana, Ella Hartenian et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science. 2014 January 3; 343(6166): 84–87.
2.  Sidi Chen, Neville E. Sanjana et al. Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis, 2015, Cell 160, 1246–1260.
3.  Rong Zhang, Jonathan J. Miner, et al., A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 2016 July 7; 535(7610): 164–168.
4.  Tobias Schmidt, Jonathan L. Schmid-Burgk & Veit Hornung, Synthesis of an arrayed sgRNA library targeting the human genome. DOI: 10.1038/srep14987.
5.  Unpublished data provided by courtesy of Emmanouil Metzakopian, Wellcome Trust Sanger Institute.
6.  Mellberg S, Dimberg A, Bahram F, et al. Transcriptional profiling reveals a critical role for tyrosine phosphatase VE-PTP in regulation of VEGFR2 activity and endothelial cell morphogenesis[J]. Faseb Journal, 2009, 23(5):1490-1502.
7.  Massinen S, Tammimies K P I. Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.[J]. Human Molecular Genetics,2009, 18(15):2802.
8.  Boussemart L, Malkamahieu H, Girault I, et al. eIF4F is a nexus of resistance to anti-BRAF and anti-MEK cancer therapies.[J]. Nature, 2014, 513(7516):105.
9.  Mellberg S, Dimberg A, Bahram F, et al. Transcriptional profiling reveals a critical role for tyrosine phosphatase VE-PTP in regulation of VEGFR2 activity and endothelial cell morphogenesis[J]. Faseb Journal, 2009, 23(5):1490-1502.
10. Gomez D, Shankman L S, Nguyen A T, et al. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections[J]. Nature Methods, 2013, 10(2):171.
11. Leuchowius KJ; Jarvius M; etc. High content screening for inhibitors of protein interactions and post-translational modifications in primary cells by proximity ligation[J]. Molecular & cellular proteomics : MCP, 2010, 9(1):178.