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?PCR反應(yīng)污染原因與對策
閱讀：260 發(fā)布時間：2022-10-17 PCR反應(yīng)的最大特點是具有較大擴增能力與很高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。
一、污染原因
1、標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
3、PCR擴增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因為PCR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
4、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。
污染的監(jiān)測
一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
防止污染的方法：
1、合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分開。最好能劃分
①標本處理區(qū);
②PCR反應(yīng)液制備區(qū);
③PCR循環(huán)擴增區(qū);
④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實驗用品及吸樣槍應(yīng)專用，實驗前應(yīng)將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
2、吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
3、預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。
4、防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。
5、設(shè)立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。
6、減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。
7、選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。