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關(guān)于蛋白質(zhì)沉淀鹽析方法探究
閱讀：68 發(fā)布時(shí)間：2025-1-21 蛋白質(zhì)通過(guò)鹽析的辦法沉淀的原理是降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出。蛋白質(zhì)的沉淀（protein precipitation），沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程。蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)沉淀常用的方法有鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、生物堿試劑與某些酸沉淀等。
在生化制備中，沉淀主要用于濃縮目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制備中常用的鹽析法多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。
一般來(lái)說(shuō)，所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過(guò)程叫鹽析。在生化制備中,許多物質(zhì)都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質(zhì)沉淀最為常見(jiàn)，特別是在粗提階段。
鹽析法分為兩類(lèi)，第一類(lèi)叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過(guò)改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過(guò)改變PH和溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。
一．影響鹽析的若干因素
1．蛋白質(zhì)濃度
高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質(zhì)的b 和Ks常數(shù)十分接近，若蛋白濃度過(guò)高，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用；在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。用于分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至zui 低限度。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。
2．離子強(qiáng)度和類(lèi)型
一般說(shuō)來(lái)，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。每一組分被鹽析出來(lái)后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來(lái)。
離子種類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。
3．PH值
一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測(cè)的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液PH值，以達(dá)到好的鹽析效果。
4．溫度
在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類(lèi)物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無(wú)特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。
二．硫酸銨的使用
硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過(guò)夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用硫酸調(diào)節(jié)至所需PH。
硫酸銨的加入有以下幾種方法：
1）、加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；
2）、加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況；
3）、透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣，需不斷測(cè)量飽和度，故多用于結(jié)晶，其它情況少見(jiàn)。
使用固體硫酸銨時(shí)：
1）、必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度，一般有0℃或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；
2）、分段鹽析中，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化。一種蛋白質(zhì)如經(jīng)二次透析，一般來(lái)說(shuō)，第一次鹽析分離范圍（飽和度范圍）比較寬，第二次分離范圍較窄。
3）、鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀全后才過(guò)濾或離心。過(guò)濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因?yàn)榇朔N情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長(zhǎng)時(shí)間的離心操作，耗時(shí)耗能。離心多用于低濃度硫酸銨溶液。